Метилйодид 13-диметиламино-3-оксо-8-гидрокси-1,5,7a,4,8,11 β (Н)-гвай-10(14)-ен-6,12-олида, обладающий антивирусным и иммуномодулирующим действием

(2009.01), 07 19/07 (2009.01), 07 239/02 (2009.01), 07 307/33 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области химии природных и физиологически активных веществ,конкретно к водорастворимой форме аминопроизводного сесквитерпенового лактона гвайанового типа - метилйодиду 13-диметиламино 3-оксо-8-гидрокси-1,5,7,4,8,11 (Н)-гвай-10( 14)ен-6,12-олида. Экспериментально установлено, что за счет иммуномодулирующего действия метилйодид 13 диметиламино-3-оксо-8-гидрокси-1,5,7,4,8,11 (Н)гвай-10(14)-ен-6,12-олида обладает высокой антивирусной активностью в концентрации 50-200 мкг/мл, в то время как препарат сравнения Амиксин в испытуемых дозах антивирусную активность в отношении вируса гриппа не проявляет.(72) Адекенов Сергазы Мынжасарович Ивасенко Светлана Александровна Сейдахметова Роза Батталовна Ахметова Сауле Балтабаевна Атажанова Гаянэ Абдулхакимовна(73) Акционерное общество Международный научно-производственный холдинг Фитохимия 23472 Изобретение относится к области химии природных и физиологически активных веществ,конкретно к водорастворимой форме аминопроизводного сесквитерпенового лактона Близким аналогом по структуре является гроссгемин (2), обладающий противоопухолевой,антивирусной,противовоспалительной,бактерицидной активностью(Рыбалко К.С. Природные сесквитерпеновые лактоны. М. Медицина, 1978.- с. 320 Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. М. Наука, 2001.- Т.2.с. 763). Аналогом по назначению является препарат Амиксин , международное название, который стимулирует образование в организме всех типов интерферонов,иммуномодулятор, стимулирует стволовые клетки костного мозга. Формы выпуска таблетки по 0,125 г тилорона, по 10 шт. в упаковке. Показания и режим дозирования вирусные гепатиты,герпес,энцефаломиелит, профилактика ОРЗ. По 0,1250,250 г (1-2 таблетки) в сутки в течение 2 дней,затем по 0,125 г через 48 часов (Вороненко В.А.,Агеева И.В. Лекарственные препараты (7000 наименований). М. АВЕОНТ, 2007.с. 800). Целью данного изобретения является изыскание природного соединения сесквитерпенового ряда,обладающего антивирусным и иммуномодулирующим действием. Целевой продукт метилйодид 13 диметиламино-3-оксо-8-гидрокси-1,5,7,4,8,11(Н)гвай-10(14)-ен-6,12-олида получен при взаимодействии гроссгемина (2) с диметиламином,и последующей реакцией с метилйодидом. Метилйодид 13-диметиламино-3-оксо-8 гидрокси-1,5,7,4,8,11(Н)-гвай-10(14)-ен-6,12 олида (метилйодид диметиламиногроссгемина (1 Бесцветное кристаллическое вещество состава 18284 т.пл. 160-162 (разл.). ИК-спектр (КВ), /см-1 3444 (ОН), 2931, 2874,2739, 2590 (-), 1757 (СО- лактона), 1736( 4.16). Пространственное строение метилйодида 13 диметиламино-3-оксо-8-гидрокси-1,5,7,4,8,11(Н)гвай-10(14)-ен-6,12-олида (1) установлено методом рентгеноструктурного анализа (фиг.1). Пример 1. Получение метилйодида 13 диметиламино-3-оксо-8-гидрокси-1,5,7,4,8,1 11(Н)-гвай-10(14)-ен-6,12-олида (1) 0.200 г гроссгемина (2) растворяют в 5 мл этанола при перемешивании прибавляют по каплям 0.24 мл диметиламина и оставляют на сутки. Ход реакции контролируют по ТСХ. Растворитель упаривают в вакууме. Получают 0.220 г бесцветного кристаллического вещества состава 17254 с.т. пл. 169-170 С. Выход 93.9. 0.200 г диметиламинопроизводного гроссгемина растворяют в 4 мл ацетонитрила, раствор охладают до 0 С и при перемешивании прибавляют к нему 0.048 мл метила йодистого, оставляют на сутки при комнатной температуре. Ход реакции контролируют по ТСХ. Растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 4 мл этил ацетата и добавляют 1 мл этанола, оставили на сутки при комнатной температуре. Получают 0.250 г бесцветного кристаллического вещества (1) состава 18284, с т. пл. 160-162 С (разл.). Выход 85,3. Исследование антивирусной активности и иммуномодулирующего действия метилйодида диметиламиногроссгемина проводилось в лаборатории культур тканей ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (г. Москва). Исследование антивирусной активности 1. Исследование антивирусной активности метилйодида диметиламиногроссгемина проводилось в лаборатории культур тканей ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского на клеточной линии почек собак МДСК с вирусом гриппа 32(штамм / (г. Москва). Вирус гриппа был предварительно адаптирован в течение 3-х пассажей к культивированию на этой линии. 23472 Задачей исследования является выявление действия метилйодида диметиламиногроссгемина при введении его за 24 часа до заражения вирусом гриппа (изучение его профилактического действия),одновременно с вирусом и через 24 часа после заражения (лечебное действие). С этой целью готовят стерильный метилйодид диметиламиногроссгемина, фильтруют его через фильтры 0.4-0.22(США), и в концентрациях 200, 100, 50, 25, 10 мкг/мл вносят в 24-ти луночные панели с предварительно выросшим монослоем клеток МДСК по вышеописанным схемам. Результаты 3-х опытов приведены в таблице 1. Таблица 1 Антивирусная активность метилиодида диметиламиногроссгемина Введение Концентрация препарата (мкг/мл) Контроль препарата клеток 200 100 50 25 10 вируса Обозначения -24 - введение препарата за 24 часа до заражения, 0 - одновременно с вирусом, 24 через 24 часа после заражения, - - нет дегенерации клеток,- 50 дегенерации клеток,- 100 дегенегации клеток. Метилиодид диметиламиногроссгемина при введении за 24 часа до заражения вирусом гриппа и одновременно с ним в концентрациях от 200 до 10 мкг/мл не подавляет размножение вируса в этой клеточной культуре. При введении исследуемого образца спустя 24 часа после инфицирования клеток вирусом гриппа при концентрациях 200, 100 и 50 мкг/мл наблюдается 100 дегенерация клеток, а при 25 и 10 мкг/мл - 50 дегенерация клеточного монослоя. Также изучалось интерферон-индуцирующее действие метилиодида диметиламиногроссгемина при экспериментальной гриппозной инфекции. В результате исследования отмечено, что введение исследуемого образца в момент заражения и через 24 часа после заражения вирусом гриппа повышает выработку ИФНдо 16-64 Ед/мл. Применение метилиодида диметиламиногроссгемина по профилактической схеме (за 24 часа до заражения) не способствует увеличению титров ИФН клетками МДСК Интерферон - индуцирующее действие метилиодида диметиламиногроссгемина. Концентрация препарата, мкг/мл 1 100 50 1 25 10 ИФА ИФА Ридостин Циклоферон Амиксин Контроль вируса Контроль клеток Титр ИФН (Ед/мл) при введении препарата по схеме За 24 часа до В момент заражения Через 24 заражения заражения 2 3 4 4 4 32 8 32 32 2 3 4 8 32 16 4 64 64 80 40 8-16 16 1024 4 2 Таким образом, экспериментально установлено,что метилиодид диметиламиногроссгемина обладает высокой антивирусной активностью за счет ИФН модулирующего действия. 2. Исследование антивирусной активности метилиодида диметиламиногроссгемина ДМА-Г) проводилось в Институте микробиологии и вирусологии (г. Алматы). Материалы и методы В работе использованы следующие ортомиксовирусы Вирус гриппа птиц, штаммы ///34,А/Черноголовый хохотун/Атырау/743/04 (136) Вирус гриппа животных ///30 (11) 3 23472 Вирус гриппа человека А/Алматы/8/98,А/Ленинград/54/1 (биологический рекомбинант штаммов //8/34 /Хабаровск/77) (11). Вирус гриппа выращивали в аллантоисной полости на 10-11 дневных куриных эмбрионов в течение 24 часов для штамма ///34, 36 часов для штаммов///30 и А/Ленинград/54/1,48 часов для штаммов А/Черноголовый хохотун/ Атырау/743/04 и А/Алматы/8/98. Антивирусную активность препаратов определяли с использованием куриных эмбрионов двумя способами а) ингибирование репродукции вируса определяли при одновременном инокулировании в куриные эмбрионы исследуемого препарата в разных концентрациях и вируса в количестве 100 ЭИД 50 с последующим определением титра гемагглютинации б) вирулицидную активность определяли путем обработки вируссодержащего материала препаратом при 37 С с последующим титрованием инфекционности обработанного материала. Инфекционный титр вирусов определяли по методуи . Для измерения степени гемолиза эритроцитов за фиксированное время в пробирки с предварительно приготовленным раствором исследуемого препарата эритроциты осаждали центрифугированием при 2000 об./мин. В течение 5 минут. Степень гемолиза определяли по разности оптической плотности супернатанта при 412 нм на спектрофотометре(при длине волны 412 нм наблюдается характерный пико-птической плотности гемапротеидная полоса Соре). Все операции проводили в изотоническом растворе 140 мМ . Нейраминидазную активность препарата определяли при помощи тиобарбитурового метода с использованием фетуина Результаты Определение гемолитической активности препарата. В результате проведенных исследований было установлено, что препарат МИ-ДМА-Г при максимальной концентрации (0,5) не обладает гемолитической активностью. Изучение антивирусной активности. В экспериментах проводилось изучение влияния исследуемого препарата в различных концентрациях штаммах вирусов гриппа птиц, животных и вируса гриппа человека. В результате проведенных исследований было установлено, что препарат МИ-ДМА-Г обладал выраженной ингибирующей активностью по отношению к вирусу гриппа человека. При максимальной концентрации 0,25 этот препарат полностью подавлял репродукцию вируса (таблица 3) Таблица 3 Влияние препарата метилиодида диметиламиногроссгемина (МИ-ДМА-Г) на вирусингибирующую активность гриппа человека, штаммы А/Ленинград/54/1 (11) и А/Алматы/8/98(Н 32) Штамм вируса гриппа А/Ленинград/5 4/1 (11) А/Алматы/8/98(Н 32) Эффективность ингибирования репродукции вирусав зависимости от концентрации исследуемого препарата 0,25 0,025 0,0025 100 0 0 100 20 0 Изучение вирусингибирующей активности препарата МИ-ДМА-Г на модели вируса гриппа птиц,штамм А/Черноголовый хохотун/ Атырау/743/04 (136) показало, что препарат при максимальной концентрации 0,25 проявляет 40 инфекционности (таблица 4). Таблица 4 - Влияние препарата метилиодида диметиламиногроссгемина(МИ-ДМА-Г) на вирусингибирующую активность гриппа птиц А/Черноголовый хохотун/ Атырау/743/04 (136) Таблица 4 Влияние препарата метилиодида диметиламиногроссгемина (МИ-ДМА-Г) на вирусингибирующую активность гриппа птиц А/Черноголовый хохотун/ Атырау/743/04 (136) Штамм вируса гриппа А/Черноголовый Атырау/743/04 (136) Эффективность ингибирования репродукции вирусав зависимости от концентрации исследуемого препарата 0,250,0250,0025 хохотун/ 40 0 0 При изучении вирусингибирующей активности препарата МИ-ДМА-Г в отношении вируса гриппа животных, штамм ///30 (11) было установлено,что антивирусная активность 4 препарата при максимальной составляло 40(таблица 5). 23472 Таблица 5 Влияние препарата метилиодида диметиламиногроссгемина (МИ-ДМА-Г) на вирусингибирующую активность гриппа животных ///30 (11) Штамм вируса гриппа Эффективность ингибирования репродукции вирусав зависимости от концентрации исследуемого препарата 0,250,0250,002540 0 0 Заключение Результаты исследований показали,что препарат метилиодид диметиламиногроссгемина способен подавлять репродукцию вирусов гриппа при концентрации 0,25. Показана более выраженная антивирусная активность препарата в отношении вирусов гриппа человека, штаммы А/Ленинград/54/1 (11) и меньшая антивирусная А/Алматы/8/98(Н 32),активность в отношении вирусов гриппа птиц,штамм А/Черноголовый хохотун/ Атырау/743/04(11). Установлено,что метилиодид диметиламиногроссгемина не влияет на структуру вириона и активность вирусных ферментов. Преимущества. За счет иммуномодулирующего действия метилйодид 13-диметиламино-3-оксо-8 гидрокси-1,5,7, ,8,11 (3(Н)-гвай-10(14)-ен-6,12 олида обладает высокой антивирусной активностью в концентрации 50-200 мкг/мл, в то время как препарат сравнения Амиксин в испытуемых дозах антивирусную активность в отношении вируса гриппа не проявляет. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ(1), обладающий антивирусной активностью за счет иммуномодулирующего действия в отношении вируса гриппа.