Способ повышения выхода биомассы при культивировании каллусов

(51) 01 33/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ фитохимии сельского хозяйства и может быть использовано при исследованиях и практических работах в области селекции растений и растениеводстве, а также для получения биомассы каллусов для производства биопрепаратов. Расширение ассортимента питательных сред и входящих в них компонентов, интенсификация скорости роста каллусов и повышение выхода биомассы - достигается тем, что в способе повышения выхода биомассы при культивировании каллусов, включающем использование питательной среды,содержащей фитогормоны,согласно изобретению, в питательную среду дополнительно вводят спиртовый экстракт растений, подвергнутый частичной очистке низкополярными растворителями и включающий дубильные вещества.(72) Мамонов Леонид Кириллович Мурсалиева Валентина Кадаматовна Пономарев Борис Николаевич Завадский Валерий Александрович Сатыбалдиева Дария Нурбатыровна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА БИОМАССЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КАЛЛУСОВ Изобретение относится к области биотехнологии, физиологии и биохимии растений,фитохимии сельского хозяйства и может быть использовано при исследованиях и практических работах в области селекции растений и растениеводстве, а также для получения биомассы каллусов для производства биопрепаратов. Известен способ получения эмбриональных культур ячменя, включающий эксплантацию незрелых зародышей на питательную среду Гамборга, дополненную концентрациями 2, 4 дихлорфеноксиуксусной кислоты и выдерживание их на питательной среде Гамборга до получения первичных каллусов, при этом первичные каллусы выдерживают на питательной среде Гамборга с концентрацией 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты от 2,0 до 16,0 мг/л в течение 2-3 месяцев до появления участков рыхлой матовой зернистой ткани, затем переносят на свежую питательную среду того же состава (предварительный патент РК 12277, кл. 01 4/00, 2002). Указанный способ характеризуется недостаточно высокой эффективностью роста каллусов и длительным периодом времени до появления участков рыхлой матовой зернистой ткани, готовой к пересадке. Известен способ стимуляции роста и развития картофеля, озимых и яровых культур, включающий обработку их белковыми стимуляторами, в качестве которых используют белкозы,являющиеся продуктами гидролиза недубленых и дубленых коллагенсодержащих животных отходов,включающие аспаратиновую кислоту, глицин,валин, лизин, пролин, глутаминовую кислоту,аланин, лейцин и пептиды с молекулярной массой 200 - 1000 (патент РФ 2096957, Кл. А 01 37/44,1997). Стимуляторы роста с пептидами животного происхождения не обеспечивают высокой эффективности роста, увеличения и ускорения выхода биомассы каллусов. Известен способ культивирования растительных клеток, тканей и органов, включающий применение минерало - органического субстрата, обладающего свойством биологического стимулятора, для роста каллусов и регенерации растений в культуре. Минерало - органический субстрат представляет собой белковый гидролизат, полученный в результате щелочного и кислотного гидролиза пептидосодержащих отходов продукции животноводства (патент РК 3851, кл. А 01 Н 4/00,1996). Стимуляторы роста с пептидами животного происхождения не обеспечивают высокой эффективности роста. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ культивирования растительных клеток, тканей и органов, включающий применение пептидов для роста каллусов, при котором используют питательные среды, содержащие пептиды растительных тканей (инновационный патент 20457, кл. А 01 33/00, 2008). Указанный способ позволяет заменить фитогормоны в среде, но не ускоряет рост в присутствии фитогормонов, то есть не обеспечивает проявления синергического эффекта,взаимопотенцирующего действие компонентов. Задачей изобретения является повышение скорости роста каллусов растений и увеличение выхода их биомассы путем создания синергического эффекта компонентов питательной среды их выращивания за счет использования фитогормонов в сочетании со спиртовым экстрактом некоторых растений,содержащим преимущественно дубильные вещества. Расширение ассортимента питательных сред и входящих в них компонентов, интенсификация скорости роста каллусов и повышение выхода биомассы - достигается тем, что в способе повышения выхода биомассы при культивировании каллусов, включающем использование питательной среды,содержащей фитогормоны,согласно изобретению, в питательную среду дополнительно вводят спиртовый экстракт растений, подвергнутый частичной очистке низкополярными растворителями и включающий дубильные вещества. При взаимодействии дубильных веществ с фитогормонами проявляется синергический эффект,существенно повышающий скорость роста каллусов и увеличивающий выход их биомассы. Сущность культивирования растительных клеток, тканей и органов заключается в образовании на искусственных питательных средах в контролируемых условиях частей растительного организма - от изолированных протопластов до зародышей. Органы, ткани, суспензии растительных клеток,протопластов в известных способах культивируют на питательных средах, включающих макро - и микроэлементы минерального питания, сахара,витамины, аминокислоты или гидролизат казеина,фитогормоны (цитокинины, ауксины, гиббереллины и биологически активные вещества). Все живые изолированные клетки и ткани разных органов растений (стебля, корня, листа, стеблевой меристемы, частей цветка покрытосемянных,гаметофитов голосемянных и споровых растений) при определенных условиях культивирования образуют каллусную ткань, состоящую из дедифференцированных клеток. Изменяя условия культивирования каллусной ткани, можно вызвать усиление роста каллусов, повышение выхода(накопления) биомассы каллусов, ускорение ее накопления, дифференциацию клеток, образование регенерационных меристем и восстановление целого растения. Морфогенез и получение растений из отдельных протопластов, клеток через культуру каллуса важнейшее звено в исследованиях с культурой растительных клеток и тканей. Предлагаемое изобретение расширяет ассортимент питательных сред за счет включения в их состав суммарных экстрактов дубильных веществ, выделенных из определенных видов растений. Эти суммарные экстракты обладают высокой стимулирующей активностью, усиливая скорость роста и повышая выход биомассы при их применении совместно с фитогормонами. При этом фитогормоны в аналогичных концентрациях,включенные в состав питательных сред, без добавления дубильных веществ, обладают в 10 - 30 раз меньшим стимулирующим эффектом. Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлены данные о влиянии спиртовых экстрактов,содержащих преимущественно дубильные вещества без фитогормонов и в сочетании с фитогормонами, на прирост биомассы каллуса пшеницы на фиг. 2 - данные о влиянии на прирост биомассы каллусной ткани моркови. На графиках фиг. 1 и фиг. 2 по оси ординат указан коэффициент, полученный из расчета (конечный вес каллусов - начальный вес каллусов)начальный вес каллусов по оси абсцисс указаны экстракты,выделенные из следующих растений Ревень туркестанский -(1),Тамарикс -(2),Тысячелистник обыкновенный (3), Герань ложносибирская. (4). Способ осуществляют следующим образом. Для выделения из растительного материала дубильных веществ используют поэтапную очистку материала органическими растворителями петролейным эфиром, дихлорметаном, пентаном,смесью гексан - этилацетат - вода (54442),этиловым эфиром и этилацетатом. Из полученного после предварительной очистки органическими растворителями растительного материала, этиловым спиртом извлекают сумму дубильных веществ, затем этиловый спирт отгоняют на роторном испарителе. В другом варианте получения дубильных веществ растительное сырье обрабатывают петролейным эфиром для удаления основной массы хлорофилла, терпеноидов и липидов, затем этиловым эфиром, который извлекает часть фенольньгх соединений, оксикорнчных кислот и катехинов, затем этилацетатом, который удаляет лейкоантоцианы, димерные проантоцианиды, эфиры оксикоричных кислот. В завершение растительный материал обрабатывают этиловым спиртом, при этом в раствор переходят дубильные вещества. Этиловый спирт отгоняют на роторном испарителе,досушивают под вентилятором и в результате получают сухой суммарный препарат, содержащий преимущественно дубильные вещества. Полученные экстракты дубильных веществ подвергают спектрофотометрическому анализу на-спектрофотометреиспектрофотометре 500. Пример 1. Внесение спиртовых экстрактов,содержащих преимущественно дубильные вещества,выделенные из растений Ревень туркестанский(1), Тамарикс (2),Тысячелистник обыкновенный -. (3), Герань ложносибирская -. (4), существенно влияет на рост и накопление каллусной ткани пшеницы. При этом сырой вес каллусов меняется в зависимости от внесенного в среду экстракта и его концентрации (фиг. 1). На фиг. 1 видно, что в контроле биомасса каллуса незначительно увеличивается к концу второго месяца культивирования и прирост не превышает 0,4. Внесение экстрактов,во всех изучавшихся концентрациях либо существенно не влияло, либо слабо ингибировало накопление биомассы. Внесение экстракта тамарикса в сочетании с гормоном 2,4 Д(2,4 Дихлорфеноксиуксусная кислота) также оказывает слабое стимулирующее действие. Значительный стимулирующий эффект и прирост биомассы каллусов пшеницы проявили экстракты. и. При этом наибольший прирост биомассы каллуса в 7 раз по сравнению с контролем отмечен в варианте экстрактом. при внесении его в концентрации 10 мг/л. В вариантах с экстрактом. максимальный прирост каллуса отмечен в случае внесения 10 мг/л экстракта в дополнении с 2,4 Д. Биомасса каллуса за два месяца культивирования увеличилась в 4 раза от первоначальной массы. Меньший прирост наблюдается в варианте с такой же концентрацией экстракта, но без гормона 2,4 Д. Пример 2. Проводили исследования по влиянию суммарных спиртовых экстрактов, содержащих преимущественно дубильные вещества,на каллусную культуру моркови. Эксперименты показали, что экстракты дубильных веществ в концентрации 100 мг/л оказывают отрицательное влияние на развитие каллуса моркови, вызывая его потемнение и гибель. В связи с этим уменьшили концентрации дубильных веществ в питательной среде до 10 мг/л и 1 мг/л, что существенно повлияло на ростовые процессы, а также морфологические характеристики каллуса (фиг. 2). Наиболее эффективное действие оказал экстракт. Достоверный прирост массы варьировал от 6,05 до 23,52. При этом сочетание экстракта с гормонами усиливает стимулирующее действие в 4 раза. Стимулирующее действие оказал также экстракт. В этом случае максимальный прирост биомассы каллуса увеличился в 8 раз и отмечался в варианте с 10 мг/л в сочетании с нафтилуксусной кислотой(НУК) и БАП (6 - Бензиламинопурин). Таким образом,спиртовые экстракты,содержащие преимущественно дубильные вещества,выделенные из разных растений, обладают различной росторегулирующей активностью в тест системах каллусной ткани пшеницы и моркови. В обеих системах стимулирующее действие на накопление биомассы каллусной ткани и синергический эффект оказывают экстракты дубильных веществ, выделенные из тысячелистника обыкновенного и герани ложносибирской. При этом наиболее эффективная концентрация для пшеницы 10 мг/л, для моркови 1 мг/л. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения выхода культивировании каллусов, биомассы при включающий использование питательной среды, содержащей фитогормоны, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вводят спиртовой экстракт растений, подвергнутый частичной очистке низкополярными растворителями и включающий дубильные вещества