Штамм вируса гриппа а/лошадь/алматы/26/07(н3n8), семейство orthomyxoviridae, род, influenzavirus a, депонированный в коллекции микроорганизмов “дгп научно исследовательский институт проблем биологической безопасности национальный центр биотехнологии кн мон рк за номером м-9-09/д, исползуемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07(38) с целью приготовления на его основе диагностических тест-систем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. Штамм вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07(38) по структуре гемагглютинина близок к эталону А/лошадь/Майами/1/63 (38), обладает высокой гемагглютинирующей (1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280),характеризуется термостабильным гемагглютинином,сохраняющим способность агглютинировать эритроциты курицы после прогревания при 56 С в течение 120 мин,репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 4,67 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии МОН РК за номером депозита М 9-09/Д. Предлагаемый вариант агглютинирует эритроциты курицы, лошади, козы, верблюда и крупного рогатого скота. Штамм вирус гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 (38) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А лошадей и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Кумекбаева Жанетта Жумагазыевна Карамендин Кобей Омертаевич Даулбаева Клара Дакишевна Ишмухаметова Наиля Галивеевна Асанова Сауле Естаевна Шахворостова Лариса Ивановна Саятов Марат Хусаинович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/ЛОШАДЬ/АЛМАТЫ/26/07(Н 38),СЕМЕЙСТВО , РОД, ДЕПОНИРОВАННЫЙ В КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДГП НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР БИОТЕХНОЛОГИИ КН МОН РК ЗА НОМЕРОМ М-9-09/Д, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических препаратов к вирусу гриппа А подтипа 38. 23175 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для научных целей и получения специфических тест-систем для диагностики высокопатогенной гриппозной инфекции лошадей. Впервые вирус гриппа от больных лошадей выделен и описан в 1956 г. во время крупной эпизоотии в Чехословакии (., 1958). Прототипный вирус А/лошадь/Прага/56 имел антигенную формулу 77. Последняя вспышка,вызванная этим возбудителем, зарегистрирована в 1979 г., тем не менее, обнаружение анти-Н 7 специфических антител у невакцинированных лошадей предполагает, что вирус может попрежнему циркулировать в скрытой, персистентной форме. В 1963 г. от больных лошадей во время крупной эпизоотии в США изолирован другой,антигенно отличающийся вирус гриппа подтипа 38 (., 1963). Прототипный вирус А/лошадь/Майями/63 попал в восприимчивую популяцию животных вместе с импортированными лошадями из Аргентины (, , 1964). В период с 1978 по 1989 гг. широкомасштабные эпизоотии гриппа 38,поразившие как вакцинированных, так и невакцинированных животных, зарегистрированы в Европе и Северной Америке (., 1979., 1983., 1993). За последние 25 лет ряд эпизоотии гриппа 38 отмечен среди лошадей в регионах ранее не пораженных этой инфекцией, так,в 1986-87 гг. возбудитель интродуцировался в популяции лошадей в Южной Африке и Индии. В настоящее время ситуация по гриппу лошадей в мире остается напряженной,по данным Информационно-аналитического центра Росссельхознадзора в 2007 г. широкомасштабные эпизоотии зарегистрированы в Австралии, Китае,Монголии, Японии (Дудникова и др., 2008). Коневодство в Казахстане является исторически сложившейся и экономически важной отраслью сельского хозяйства,имеющей глубокие национальные корни и перспективы развития в будущем. В то же время ситуация по гриппу лошадей в республике остается напряженной. В 2007 г. эпизоотии зарегистрированы в ЮжноКазахстанской,Жамбылской,Алматинской,Карагандинской и Восточно-Казахстанской областях. Так, в августе 2007 г. в коневодческих хозяйствах Алматинской области наблюдались массовые респираторные заболевания и гибель лошадей, в ходе которых выделено пять изолятов вируса гриппа подтипа 38 (Кыдырманов и др.,2009). Филогенетический анализ последовательностей генов НА вируса гриппа лошадей 38 показал, что они возникли как единая линия, но в середине 1980 годов разделились на две эволюционные ветви,которые по настоящее время циркулируют независимо друг от друга (., 1989., 1996). Вирусы одной линии (типа) циркулируют преимущественно в Европе, в то время как представители второй на американском континенте, они различаются по антигенной 2 реактивности, что может отражаться на качестве вакцинных и диагностических препаратов. Показано, что вакцины содержащие вирус американской линии менее эффективны по сравнению с гомологичной вакциной при заражении вирусом 38 европейской разновидности ( 2000). В результате генетического анализа штаммов вируса гриппа 38 1989 г. установлено их существенное отличие от ранее циркулировавших вариантов, на основании чего М.. (1991) предположили, что в это время произошло значительное антигенное изменение возбудителей гриппа лошадей. На основании этого Международное эпизоотическое бюро и Всемирная организация здравоохранения в мае 1992 г. рекомендовали включать в состав вакцин штаммы 1989 г., а также сосредоточить усилия на мониторинге и изучении свойств выделяемых изолятов вируса гриппа лошадей (, ,1993). Задачей изобретения является получение нового,оригинального казахстанского штамма вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07(38) для использования его в качестве диагностикума с целью выявления специфических антител в сыворотках крови при вакцинальном и естественном инфицировании лошадей современными вариантами вируса гриппа А подтипа 38, а также для проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. Изолированный казахстанский вариант вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 (38) отличается от эталонных и ранее выделенных штаммов, и обладает уникальными антигенными и биологическими характеристиками,что обеспечивает технический результат. Предлагаемый штамм А/лошадь/Алматы/26/07(38) выделен из носового смыва больной лошади во время вспышки острой респираторной инфекции в коневодческом хозяйстве Алматинской области в 2007 г. В реакции торможения гемагглютинации он не взаимодействовал с сыворотками к референсным вирусам с подтипом гемагглютинина Н 7(А/тюлень/Массачусетс/1/80,А/скворец//Англия/9 83/79, А/курица/Пакистан/1369-2/95), а также с сывороткой к эталонному, прототипному штамму подтипа 77 А/лошадь/Прага/1/54. В антигенном отношении он оказался наиболее близким к референсному варианту А/лошадь/Майами/1/63(38), с иммунной сывороткой к которому он в реакции торможения гемагглютинации реагировал в титре 1160 (табл. 1). С диагностическими сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина , Н 2, Н 4-Н 16 получены отрицательные результаты. Нейраминидаза изолята А/лошадь/Алматы/26/07(38) по результатам реакции подавления нейраминидазной активности отнесена к подтипу 8 (табл. 2). С диагностическими сыворотками,содержащими антитела к нейраминидазам 1 - 7,9 получены отрицательные результаты. Новый штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем 23175 биологической безопасности Национального центра по биотехнологии КН МОН РК (депозитМ-9-09/Д). Антигенная структура. Выделенный штамм изучали в реакциях торможения гемагглютинации и подавления нейраминидазной активности с использованием набора референс-сывороток к вирусам гриппа с подтипами гемагглютининов -И 16 и нейраминидазы 1-9 (табл. 1, 2). Результаты,представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что штамм А/лошадь/Алматы/26/07 имеет антигенную формулу 38. Более детальная характеристика этого вируса дана с помощью определения нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина методом секвенирования. Результаты сравнительного анализа 1703 нуклеотидов гена гемагглютинина штамма А/лошадь/Алматы/26/07 с аналогичными последовательностями шести различных референсных вирусов гриппа лошадей подтипа 38 1989-2003 гг. выделений представлены в таблице 3. Из данных таблицы видно, что, штамм А/лошадь/Алматы/26/07 отличается как от эталонных вариантов американской линии(///1/93,///1/03,///1/03), так и и от вирусов европейского происхождения (///89,///13/02, ///93) на 25. Адаптационные свойства. Штамм А/лошадь/Алматы/26/07(38) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре с инфекционным титром 4,67 ЭИД 50/0,2 мл. Он характеризуется высокой гемагглютинирующей (1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в реакции торможения гемагглютинации 11280). Свойства агглютинации. Исследуемый штамм активно агглютинирует эритроциты курицы,лошади, козы, верблюда и крупного рогатого скота. Терморезистентностъ. По термочувствительности гемагглютинина штамм А/лошадь /Алматы/26/07 (38) отнесен к термостабильному варианту, поскольку сохраняет способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 120 мин. Ингибиторочувствительностъ. Предлагаемый штамм оказался ингибиторочувствительным к нативным сывороткам морской свинки, барана,лошади, а также к прогретой при 62 С сыворотке лошади. Элюирующая активность. Время элюции с нативных куриных эритроцитов вируса А/лошадь/Алматы/26/07(38) при 37 С составляет 4 ч. К штамму А/лошадь/Алматы/26/07 (38) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы Шиншила массой 2,53 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 11280. Таким образом,сравнительное изучение казахстанского штамма вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07(38) с другими штаммами вируса этого подтипа///1/93,///1/03,///1/03,///89,///13/02,///93 позволило выявить различия между ними по нуклеотидному составу важнейшего поверхностного антигена - гемагглютинина. Выявленные отличия указывают на то, что вирус А/лошадь/Алматы/26/07 (38) не идентичен ранее выделенным эталонным штаммам вируса гриппа А подтипа 38, а является новым природным,эпизоотическим вариантом высокопатогенного вируса гриппа(38). Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 в реакции торможения гемагглютинации с диагностическими сыворотками Иммунная сыворотка к референсному штамму А/Порт Чалмерс/1/73 (32) А/лошадь/Майами/1/63 (38) А/утка/Украина/63 (38) А/индюк/Англия/69 (32) А/чирок/Коргалжын/1797/06 (38) А/лошадь/Прага/1/54 (77) А/тюлень/Массачусетс/1/80 (77) 23175 Продолжение таблицы 1 А/скворец/ЫО/Англия/983/79 (71) 1280 10 А/курица/Пакистан/1369-2/95 (73) 1280 10 Примечание - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы изолята вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 в реакции подавления нейраминидазной активности Изолят А/лошадь/Алматы/26/0 Примечание- реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности. Таблица 3 Сходство и различие последовательности нуклеотидов гена гемагглютинина штамма вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 с эталонными вирусами гриппа(38)// Ген НА вируса / 13/02 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Национальный центр биотехнологии КН МОН РК за номером М-9-09/Д,используемый для приготовления диагностических препаратов.