Способ биоиндикации устойчивости растений к пестицидам

(51) 01 33/00 (2006.01) 01 3/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ БИОИНДИКАЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ПЕСТИЦИДАМ(57) Изобретение относится к области физиологии растений и экологии и может быть использовано для определения устойчивости растительного организма хлорорганическим пестицидам. Повышение точности биоиндикации и упрощение способа достигается тем, что в способе биоиндикации устойчивости растений к пестицидам по содержанию хлорофилла в листьях растения,согласно изобретению, из измельченных листьев растения готовят экстракт с помощью ацетона и определяют оптическую плотность экстракта при длинах волн 665 и 649 нм, соответствующих максимумам поглощения волныихлорофилла в 80 растворе ацетона, и при большем содержаниихлорофилла по сравнению с содержаниемхлорофилла идентифицируют устойчивость растений к пестицидам.(72) Нуржанова Асиль Аруновна Рахимбаев Избасар Рахимбаевич Жамбакин Кабылбек Жапарович Седловский Анатолий Иванович Нам Светлана Валентиновна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Ломагин Л.Г., Ульянова Л.В. Новый тест на загрязненность воды с использованием ряски // Физиология растений, 1993, т.40,2, с.327 21875 Изобретение относится к области физиологии растений и экологии и может быть использовано для определения устойчивости растительного организма к хлорорганическим пестицидам. Известен способ биоиндикации устойчивости растений к пестицидам, в качестве показателей для которого используют количество и размеры листецов, длину корней рясок, специфичную окраску листецов на загрязнитель, содержание хлорофилла,количество хлоропластов в эпистрофном положении после воздействия сильного света. Под счет числа листецов позволяет выявить жизнеспособность популяции рясок в загрязненной среде. В основе способа положено изменение положения хлоропластов в эпистрофном и парастрофном положении. Подсчитывают число хлоропластов, находящихся в эпистрофном положении, т.е. перпендикулярном положении к лучам света. После интенсивного освещения через 10 минут количество таких хлоропластов уменьшается до 0. При чиной тому переход большинства хлоропластов в парастрофное положение, т.е. они прижимаются к краям клеточной стенки. У листецов, поврежденных действием пестицидов, хлоропласты не отходят или частично отходят к краям клетки (Ломагин Л.Г., Ульянова Л.В., Новый тест на загрязненность воды с использованием ряски - Физиология растений - 1993,т. 40,2, с. 327). При осуществлении данного способа не удается просмотреть все ткани листеца, что снижает точность биоиндикации. Кроме того, способ характеризуется сложностью реализации и длительностью анализа. Задачей изобретения является разработка способа биоиндикации для определения устойчивости растительного организма к хлорорганическим пестицидам. Достигаемый результат - повышение точности биоиндикации и упрощение способа. Указанный результат достигается тем, что в способе биоиндикации устойчивости растений к пестицидам по содержанию хлорофилла в листьях растения, согласно изобретению, из измельченных листьев растения готовят экстракт с помощью ацетона и определяют оптическую плотность экстракта при длинах волн 665 и 649 нм,соответствующих максимумам поглощения волныихлорофилла в 80 растворе ацетона и при большем содержаниихлорофилла по сравнению с содержаниемхлорофилла идентифицируют устойчивость растений к пестицидам. Растительный покров находится под воздействием огромного числа антропогенных факторов среды и представляет собой уязвимый компонент биоты, так как он является первичным звеном в трофической цепи, выполняющий основную роль в поглощении разнообразных загрязнителей. Не все популяции растений обладают генетической структурой, обеспечивающей устойчивость по отношению к существующим концентрациям загрязнений. Однако, в некоторых случаях скорость увеличения количества загрязнений в окружающей среде дает возможность растениям приспособиться к изменению условий окружающей среды. В первую 2 очередь воздействию подвергаются физиологические системы клеток растений, регулирующие поступление загрязняющих веществ, а также химические реакции, ответственные за процессы фотосинтеза и дыхания. Известно, что основным фотосинтетическим пигментом растений является хлорофилл. Установлено, что процесс фотосинтеза очень чувствителен к изменениям условий среды. Интенсивность фотосинтеза под влиянием хлорорганических пестицидов у одних видов снижается, например, у яблони, а у картофеля повышается. В предлагаемом изобретении содержание хлороиллаии их количественное соотношение испольовано в качестве биоиндикаторного показателя стрессовой на грузки в отношении пестицидов. Заявленный способ позволяет за короткий период времени спектрофотометрически определить устойчивость растений к хлорорганическим пестицидам по содержаниюихлорофилла в листьях растений. Способ осуществляют следующим образом. В период цветения срезают у растений листья. Для экстракции пигмента из растительных тканей листья в количестве 100 мг измельчают ножницами,а затем помещают их в ступку, добавляют на кончике скальпеля О 3 и приливают 4-5 мл ацетона, тщательно растирают в течение 10 минут. Полученную вытяжку сливают по палочке на стеклянный фильтр, вставленный в колбу Бунзена. При помощи насоса жидкость отсасывают и в ступку добавляют немного ацетона, растирают и снова отсасывают. Эту процедуру повторяют 3 раза. Затем вытяжку переливают в мерную колбу. Колбу Бунзена ополаскивают несколько раз небольшими порциями ацетона и доводят чистым ацетоном объем вытяжки в мерной колбе до метки. Концентрацию хлорофиллаиопределяют на спектрофотометре. Для этого часть полученного экстракта наливают в одну кювету спектрофотометра, а вторую кювету заполняют чистым растворителем (80 ацетоном). Чистый растворитель используют, как контрольный. Кюветы помещают в кюветную камеру спектрофотометра и определяют оптическую плотностьэкстракта (длина волны 665 и 649 нм,соответствующая максимумам поглощения волны хлорофиллаив 80 растворе ацетона). Концентрацию хлорофилла считают по формуле С 13,7- 665 - 7,60 649 С 25,8 649 -7,60665 где Си С- концентрация хлорофилловиСодержание пигментов в растительном материале, мг/г сырой массы (А) подсчитывают первоначально содержание их в 100 мл, а затем рассчитывают их содержание в 1 г С мг - 1 лмгС мг х 1 л / 0,01 л Х - 0,01 лмг - 0,1 г А мг/гХ мг х 1 г/0,1 г А-1 г Результаты исследования Из территории бывших хранилищ пестицидов были отобраны толерантные к пестицидам 21875 следующие виды растений.(эгилопс цилиндрический). В условиях оранжереи был поставлен эксперимент. Семена этих растений выращивали на загрязненной пестицидами почве в сосудах. В качестве субстрата использовали почву с территории хранилищ пестицидов. Перед экспериментом почву просеяли через сито(3 мм) и затем тщательно пере мешали. Затем галькой заполнили дно сосуда (2/3 дна сосуда, масса 500 г). Далее дренаж закрывали марлей и сверху насыпали речной песок 2/3 от дренажа (масса песка 500 г) и снова закрывали марлей. Затем сосуд заполняли почвой (масса почвы 5000 г). Для того чтобы почва не высыхала, сверху насыпали один слой песка. После набивки сосуд взвешивали. Общая масса 5000 г. Опыты в оранжерее повторяли 3 раза. Посев семян провели в течение одного и того же дня. Полив проводили ежедневно утром проточной водой (объем воды - 400 мл на сосуд). Содержание хлорорганических пестицидов в почве до эксперимента определяли с помощью стандартных методов ЕРА на / хроматографе 6890 с использованием капиллярной колонки НР-5 и электронно-захватного детектора. Данные представлены в (таблице 1). Установлено, что почва на территории хранилищ пестицидов загрязнена хлорорганическими пестицидами изомерами ГХЦГ (гексахлорциклогексана)- ГХЦГ,- ГХЦГ,- ГХЦГ и метаболитами ДДТ дихлордифенилдихлорэтилен (4,4 - ДДЭ), дихлордифенилдихлорэтан (2, 4 - ДДД) дихлордифенилтрихлорэтан (4, 4 - ДДТ). В почве из 1-ой Точки общая сумма хлороргаических пестицидов составляла 734 мкг/кг, из 2-ой точки - 6270 мкг/кг. Основным загрязнителем почвы из 1-ой Точки были 4,4-ДДТ (36536 мкг/кг), из 2-ой Точки - 4,4-ДДЭ и 4,4-ДДТ (1869102 мкг/кг и 4187284 мкг/кг). В период цветения спектрофотометрическим методом определили содержаниеихлорофилла в листьях у 7 видов растений ( ,полынь однолетняя,,,,и). Установлено, что содержание р хлорофилла примерно в 2 раза выше, чем а хлорофилла в листьях изученных видов растений, независимо от концентрации хлорорганических пестицидов в почве. Результаты представлены в таблице 2. Так, например, в листьях полыни однолетней,произрастающей на загрязненной почве (концентрация хлорорганических пестицидов 734 мкг/кг) содержание хлорофилла а составило 0,2050,12 мг/г,хлорофилла- 0,5870,22 мг/г. Аналогичные результаты бы ли получены при произрастании данного вида на загрязненной почве, где остаточное количество пестицидов составляло 6270 мкг/кг. Содержание хлорофиллабыло выше чем, содер-жание хлорофилла а (0,318 0,16 мг/г и 0,1760,25 мг/г соответственно). Пример расчета значения количества хлорофиллов в сырой массе Пример расчета значения количества хлорофилла а в сырой массе С- 13,70 х 0,330 - 7,60 х 0,3252,05 мг 2,05 мг х 1 л/0,01 л 0,0205 мг 0,0205 мг х 0,1 г/ 1 г - 0,205 мг/г Пример расчета значения количества хлорофиллав сырой массе С- 25,8 х 0,325 - 7,60 х 0,3305,87 мг 5,87 мг мг х 1 л/0,01 л 0,0587 мг 0,0587 мг х 0,1 г/ 1 г 0,587 мг/г Таблица 1 Остаточное количество хлорорганических пестицидов в почве из территории хранилищ пестицидов до эксперимента Вариант а-ГХЦГ,4,4 2,4 4.4 ДДТ,опыта до мкг/кг гхцг,гхцг,ДДЭ,ДДД,мкг/кг посева семян мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг пдк 0 100 100 100 0 100 1 679 17623 223 853 1 б 3 36536 2 157 835 134 1869102 1016 4187284 1 - хранилище пестицидов, расположенных в пос. Прямой путь Карасайского района. 2 - хранилище пестицидов, расположенных в пос. Бекбулак Карасайского района. Таблица 2 Содержание хлорофиллов в листьях у видов растений, толерантных к хлорорганическим пестицидам Виды растений эгилопс цилиндрический 1 0,175 0,183 0,1490,10 0,3220,18 2 0,186 0,207 0,2050,17 0,4480,25 1 - хранилище пестицидов, расположенных в пос. Прямой путь Карасайского района. 2 - хранилище пестицидов, расположенных в пос. Бекбулак Карасайского района. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ биоиндикации устойчивости растений к пестицидам по содержанию хлорофилла в листьях растения, отличающийся тем, что из измельченных листьев растения готовят экстракт с помощью ацетона и определяют оптическую плотность экстракта при длинах волн 665 и 649 им,соответствующих максимумам поглощения волныихлорофилла в 80 растворе ацетона, и при большем содержаниихлорофилла по сравнению с содержаниемхлорофилла идентифицируют устойчивость растений к пестицидам.