Способ промышленного культивирования биомассы штаммов нефтеокисляющих бактерий

(51)7 12 1/26, 02 3/34 // (12 1/26, 12 140) ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Прохорова Светлана Вениаминовна Толмачева Елена Владиленовна Розвага Роман Иванович Клец Александр Николаевич Космухамбетов Александр Равильевич Давыдов Георгий Иванович Проценко Елена Александровна Абрамова Ольга Владимировна Нугербеков Амиргали Карымханович Дементьева Татьяна Александровна(73) Государственное научно-производственное объединение промышленной экологии Казмеханобр(54) СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОМАССЫ ШТАММОВ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии. Оно может быть использовано на предприятиях по добыче, переработке и транспортировке нефти и хранению нефтепродуктов. Способ промышленного культивирования биомассы штаммов нефтеокисляющих бактерий заключается в том, что вводят суспензию штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий,содержащую (1,3-3,0)х 1015-18 кл/см 3, в питательную среду, в качестве которой используют питательную среду следующего состава, кг/м 3 дигидрофосфат аммония 2,1-2,5 хлорид калия 1,0-1,2 вода техническая до 1 м 3 в соотношении питательная среда суспензия штамма 11, в которую добавляют неочищенную нефть в количестве 1,3-1,7 кг/м 3, и выращивают при температуре 27-32 С и аэрации воздухом с удельным расходом 8-10 м 3/чм 2 с образованием кипящего слоя диспергируемой жидкости с диаметром пузырьков 1,5-2,0 мм до достижения первоначального титра суспензии штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий. Способ позволяет получить биомассу штамма или консорциума штаммов в более короткие сроки по сравнению с известными способами, а также снизить ее себестоимость. 8293 Изобретение относится к области биотехнологии и экологии. Оно может быть использовано на предприятиях по добыче, переработке и транспортировке нефти и хранению нефтепродуктов. Известна классическая среда ВорошиловойДиановой для культивирования биомасс штаммов нефтеокисляющих бактерий (Родина А.Г. Методы водной микробиологии Практическое руководство. М.-Л. Наука, 1965, с. 194) состава, г/дм 3 Н 431,0 К 2 НРО 4 - 1,0 КН 2 РО 4 - 1,0 М 47 Н 2 О - 0,2 Са 26 Н 2 О - 0,02 е 36 Н 2 О - 2 капли вода - до 1000 см 3. При этом способ культивирования заключался во введении в указанную минерализованную среду источника углеродного питания -углеводорода,например нефти или нефтепродукта (жидкий 1,2 мл или твердый 0,5-1,0 г) и смывов с косяков определенной культуры с последующим термостатированием содержимого при температуре 2730 С и аэрацией воздухом при рН 6,0-7,0 в течение 3-6 суток до достижения рабочего титра (на уровне 10131015 кл/см 3). Будучи приемлемым для поисковых прикладных исследований, способ малопригоден для промышленной наработки биомасс штаммов нефтеокисляющих бактерий вследствие большого наименования дефицитных реагентов, особенно замещенных фосфатов, и относительной длительности процесса культивирования. Наиболее близким к изобретению является способ культивирования нефтеокисляющих штаммов бактерий, в частности 36 (а. . СССР 1076446, кл. 12 15/00, С 02 3/34, С 12 1/40, 1984), заключающийся во внесении 2,5 см 3 источника углеродного питания (неочищенной нефти) и суспензии клеток бактерий 36 1,5 х 107 в 50 мл минерализованной среды состава,г/см 3 К 2 НР 4 - 10,0, КН 2 РО 4 - 1,0 Н 43 - 2,0,вода - до 1000 см 3 с последующим инкубированием смеси на качалке при 30 С в течение 5-6 суток с получением титра клеток биомассы на уровне 1,5 х 1012 кл/см 3. Способ обладает следующими существенными недостатками культивирование биомассы штамма бактерий требует относительно много времени (5-6 суток) из-за весьма устойчивой гетерогенной среды на границе жидкость-нефть при ее встряхивании характеризуется относительно большими расходами реагентов для культивирования биомассы (по сравнению с классической средой ВорошиловойДиановой расходы Н 43 и К 2 НРО 4, соответственно, в 2 и 10 раз больше), что приводит к удорожанию себестоимости получаемых биомасс и эксплуатационных затрат культивирование осуществляется исключительно лишь для получения биомассы одного вида бактерий, а не для культивирования консорциумов или природных ассоциаций штаммов нефтеокисляющих бактерий. Задача изобретения - разработка способа промышленного культивирования биомассы штаммов нефтеокисляющих бактерий, позволяющего культи 2 вировать как отдельные штаммы, так и их композиции (консорциумы или природные ассоциации), характеризующегося более короткими сроками культивирования и относительно низкой себестоимостью получаемых биомасс. При этом достигается следующий технический результат- способ культивирования позволяет получать биомассу как отдельных штаммов бактерий, так и их композиций (консорциумов или природных ассоциаций) в 2,5-3 раза быстрее (требуется времени 2-3 суток)- способ культивирования предусматривает снижение себестоимости минерализованной питательной среды по сравнению со средой по прототипу в 6,3-7,5 раза- способ позволяет снизить по сравнению с прототипом себестоимость получаемой биомассы штамма (штаммов) бактерий в 6 раз (стоимость 1 т биомассы по заявляемому способу и прототипу, соответственно, составляет 150 дол. и 900 дол.)- способ позволяет снизить годовые эксплуатационные затраты при производстве биомассы также в 6 раз (они, соответственно, составляют 3000 дол. и 18000 дол. для получения 20 т биомассы). Способ промышленного культивирования биомассы штаммов нефтеокисляющих бактерий включает введение суспензии штамма нефтеокисляющих бактерий в питательную среду, содержащую калий,азот, фосфор в виде минеральных солей и воду с последующим добавлением неочищенной нефти в качестве источника углерода, и выращивание при аэрации, при котором вводят суспензию штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий,содержащую (1,3-3,0)х 1015-18 кл/см 3, в питательную среду, в качестве которой используют питательную среду следующего состава, кг/м 3 дигидрофосфат аммония 2,1-2,5 хлорид калия 1,0-1,2 вода техническая до 1 м 3 в соотношении питательная среда суспензия штамма 11, в которую добавляют неочищенную нефть в количестве 1,3-1,7 кг/м, и выращивание осуществляют при температуре 27-32 С и аэрации воздухом с удельным расходом 8-10 м 3/чм 2 с образованием кипящего слоя диспергируемой жидкости с диаметром пузырьков 1,5-2,0 мм до достижения первоначального титра суспензии штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий. Существенные отличия данного способа от прототипа- три ингредиента известной минерализованной среды (Н 43, К 2 НРО 4 и КН 2 РО 4) заменены на один новый ингредиент, как биогенный источник азота и фосфора (Н 4 Н 2 РО 4)- в минерализованную питательную среду введен новый ингредиент (К), как биогенный источник калия вместо К 2 НРО 4 и КН 2 РО 4- вместо дистиллированной воды в питательную среду вводят техническую воду, как биогенный источник микроэлементов (кальция, магния и железа)- в объемном соотношении минерализованной питательной среды и инокулята отдельного штамма бактерий, консорциума либо природной ассоциации микроорганизмов, равного 11- в количественных расходах сырой нефти как источника углеродного питания, равных 1,31,7 кг/м 3, вместо 44,2 кг/м 3- в оптимальных режимах культивирования нарабатываемой биомассы штаммов бактерий температура 2732 расход воздуха для аэрации - 810 м 3/чм 2 (вместо нелимитированной аэрации) наличие кипящего слоя жидкости при аэрации смеси(вместо гетерогенной среды вода-нефть). Нарушения состава используемой для культивирования минерализованной питательной среды и условий ферментационного процесса получения биомассы культур (объемного соотношения среды и инокулята биомасс штаммов бактерий, расходов источника углеродного питания - сырой нефти, пределов рН и температуры, расходов воздуха для аэрации и отсутствие кипящего слоя культивируемой жидкости) не позволяют получить вышеуказанный технический результат. Разработанный способ культивирования биомассы нефтеокисляющих штаммов бактерий освоен на опытном производстве ГНПО ПЭ Казмеханобр. Он позволяет внедрить биотехнологию крупнотоннажного производства биомассы для очистки сточных вод, почв и других объектов от нефти и нефтепродуктов при аварийных ситуациях и экологических катастрофах. Промышленное культивирование биомассы отдельных штаммов, консорциумов либо природных ассоциаций нефтеокисляющих бактерий, представленное ниже в примерах, осуществляли в лабораторных и производственных условиях с использованием инокулятов биомассы, питательной рабочей среды и ферментаторов, работающих по принципу кипящего слоя с диспергацией воздухом до размеров пузырьков 1,5-2,0 мм, следующим образом. В ферментатор вносили питательную минерализованную среду состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4 - 2,1-2,5, К 1,0-1,2 вода техническая - до 1,0 м 3 и инокулят соответствующего штамма (штаммов) бактерий в объемном соотношении 11, затем вносили источник углеродного питания - сырую нефть в количествах 1,3-1,7 кг/м 3 питательной среды и смесь подвергали аэрации воздухом при расходах 8-10 м 3/чм 2 в пределах температуры 2732 С и рН 6,7-7,0. Ферментаторы обеспечены диспергатором для распыления пузырьков воздуха с диаметром 1,5-2 мм, подаваемого снизу вверх по всей высоте культуральной жидкости с образованием кипящего слоя. Через определенные промежутки времени отбирали пробы культуральной жидкости, количество жизнеспособных клеток бактерий определяли методом предельных разведений путем высева на МПА. При достижении первоначального титра вводимого инокулята процесс ферментации (культивирования) завершался. П р и м е р 1, относящийся к культивированию биомассы штамма бактерий 36 по прототипу. Культивированию с использованием встряхивающего аппарата подвергали смесь, состоящую из 100 мл минерализованной среды состава, г/дм 3 К 2 НРО 4 - 10,0 КН 2 РО 4 - 1,0 43 - 2,0 с введением 5,0 мл неочищенной нефти и суспензии клеток бактерий 1,5 х 107 кл/см 3 при 30 С. Процесс культивирования завершился через 6 суток с получением титра биомассы 1,5 х 1012 кл/см 3. Те же количества питательной среды, биомассы и источника углеродного питания - сырой нефти были подвергнуты ферментационному культивированию в ферментаторе, имитирующем производственные условия, при температуре 30 С, рН 6,7 и удельном расходе воздуха 9 м 3/чм 2. Удвоение титра клеток в полученной биомассе наблюдалось в течение 4,5 суток. П р и м е р 2, относящийся к культивированию биомассы отдельных штаммов бактерийГНПО ПЭ-Р-6 илиГНПО ПЭ-Р-5. В ферментатор емкостью 0,5 м 3 загружают 0,2 м 3 минерализованной питательной среды состава,кг/м 3 Н 42 РО 4 - 2,1 К - 1,0 вода техническая до 1,0 м 3, а затем вводят 0,2 м 3 инокулята биомассыГНПО ПЭ-Р-6 (рабочий титр 1,5 х 1016 кл/см 3) и прибавляют 0,26 кг неочищенной нефти при рН среды 6,7. Смесь подвергают ферментации при температуре 27 С и удельном расходе воздуха 8,0 м 3/чм 2. Максимальная плотность полученной биомассы (1,5 х 1016 кл/см 3) достигается в течение 2,5 суток. Выход продукта ферментации 0,4 м 3.(100 ). В тех же самых условиях ферментации подвергают 0,2 м 3 минерализованной питательной среды состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4 - 2,5 К - 1,2 вода техническая - до 1,0 м 3, с последующим введением 0,34 кг неочищенной нефти и 0,2 м 3 инокулята биомассы .ГНПО ПЭ-Р-5 (рабочий титр 1015 кл/см 3) при рН 7,0 удельном расходе воздуха 10 м 3/чм 2 и температуре 32 С. Максимальная плотность полученной биомассы (1,5 х 1015 кл/см 3) достигается в течение 2 суток. Выход продукта ферментации 0,4 м 3 (100 ). П р и м е р 3, относящийся к культивированию консорциума штаммов бактерийГНПО ПЭ-Р-6,ГНПО ПЭР-5 иГНПО ПЭ-В-7. В ферментатор емкостью 0,25 м 3 загружают 0,1 м 3 минерализованной питательной среды состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4 - 2,1 К - 1,0 вода техническая - до 1,0 м 3, а затем вводят 0,1 м 3 биомассы консорциума, состоящей из равных объемов штаммов нефтеокисляющих бактерий (.ГНПО ПЭ-Р 6, .ГНПО ПЭ-Р-5 и .ГНПО ПЭ-В-7) с общим титром 1015 кл/см 3, прибавляют 0,13 кг неочищенной нефти. Смесь подвергают ферментации при температуре 27 С, рН 6,7 и удель 3 ном расходе воздуха 8,0 м /чм . Максимальная плотность полученной биомассы достигается в течение 56 часов. Выход продукта ферментации составил 0,2 м 3 (100 ). В аналогичных условиях ферментации подвергают смесь, состоящую из 0,1 м 3 минерализованной питательной среды состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4 - 2,1 К - 1,0 вода техническая - до 1,0 м 3 добавляют 0,1 м 3 биомассы того же консорциума штаммов бактерий с общим титром 1,5 х 1017 кл/см 3 с введением 0,17 кг неочищенной нефти. Содержимое подвергают аэрации воздухом с удельным расходом 10,0 м 3/чм 2 при температуре 32 С и рН 7,0. Максимальная плотность биомассы (1017 кл/см 3) достигается в течение 42 часов. Выход продукта ферментации составил 0,2 м 3 (100 ). П р и м е р 4, относящийся к культивированию биомассы природной ассоциации микроорганизмов,выделенной из нефтешламов производственного объекта по хранению и переработке нефти. В ферментатор емкостью 0,1 м 3 загружают 0,04 м 3 минерализованной питательной среды состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4-2,1 К-1,0 и вода техническая - до 1,0 м 3, а затем вводят 0,04 м 3 природной ассоциации нефтеокисляющих штаммов бактерий,состоящей из микроорганизмов ( . 4, . 5,. 6,. 9,. 7 и. 8) с общим титром 3,0 х 1018 кл/см 3 с прибавлением 0,052 кг неочищенной сырой нефти. Смесь подвергают аэрации при удельном расходе воздуха 8,0 м/чм 2, температуре 27 С и рН 6,7. Максимальная плотность биомассы достигается в течение 48 часов. Выход биомассы составил 0,08 м 3 (100 ). В аналогичных условиях ферментации (аппарат емкостью 0,1 м 3) подвергают смесь, состоящую из 0,04 м 3 минерализованной питательной среды состава, кг/м 3 Н 4 Н 2 РО 4 - 2,5 К - 1,2 вода техниче ская - до 1,0 м 3 с прибавлением 0,04 м 3 инокулята той же природной ассоциации и того же состава нефтеокисляющих микроорганизмов (титр 3,0 х 1018 кл/см 3), а также 0,068 кг неочищенной сырой нефти. Содержимое подвергают аэрации воздухом с удельным расходом 10,0 м 3/чм 2 при температуре 32 С и рН 7,0. Первоначальный общий титр клеток бактерий был достигнут в течение 42 часов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ промышленного культивирования биомассы штаммов нефтеокисляющих бактерий, включающий введение суспензии штамма нефтеокисляющих бактерий в питательную среду, содержащую калий, азот, фосфор в виде минеральных солей и воду с последующим добавлением неочищенной нефти в качестве источника углерода, и выращивание при аэрации, отличающийся тем, что вводят суспензию штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий, содержащую (1,3-3,0)х 1015-18 кл/см 3, в питательную среду, в качестве которой используют питательную среду следующего состава, кг/м 3 дигидрофосфат аммония 2,1-2,5 хлорид калия 1,0-1,2 вода техническая до 1 м 3,в соотношении питательная среда суспензия штамма 11, в которую добавляют неочищенную нефть в количестве 1,3-1,7 кг/м 3, и выращивание осуществляют при температуре 27-32 С и аэрации воздухом с удельным расходом 8-10 м 3/чм 2 с образованием кипящего слоя диспергируемой жидкости с диаметром пузырьков 1,5-2,0 мм до достижения первоначального титра суспензии штамма или консорциума штаммов нефтеокисляющих бактерий.