Штамм клубеньковых mesorhizobium cicer ю-2н, используемый в качестве средства для получения бактериального препарата под нут

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ адаптированного для почв Казахстана под современные сорта нута и обладающего высокой азотфиксирующей способностью. Предложен новый штамм клубеньковых бактерийЮ-2 Н, применяемый в качестве средства для получения удобрения под нут. Штамм депонирован в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН Республики Казахстан КН МОН Республики Казахстан под номером ИМиВ В-22 (27.08.2014) и предназначен для получения бактериального препарата под нут с высокой азотфиксирующей активностью способностью клубеньковых бактерий. Титр клеток дляЮ-2 Н на варианте среды с бобовым отваром, состава, г/л Н 2 Р 4 - 1,0 4-0,3 сахароза - 8,0 горох - 50,07,0 равен 6,10,19109 КОЕ/мл. Конкурентная способность клубеньковых бактерий штаммаЮ-2 Н равна 25,7, азотфиксирующая способность равна 14,50,12 нмоль 24/ч/1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Штамм проявляет высокий уровень роста на модифицированной среде с бобовым отваром и активно фиксирует атмосферный азот.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Треножникова Людмила Петровна Ултанбекова Гульнар Даулетбаевна Шорабаев Ерик Жарылкасынович Ю-2 Н,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ПОД НУТ(57) Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых растений и предназначено для изготовления бактериального препарата клубеньковых бактерий под нут. Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве бактериального удобрения. Задачей изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий, используемого для получения бактериального препарата под нут, 30605 Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерийЮ-2 Н для получения микробиологического удобрения,повышающего урожайность нута. Предложен новый штамм клубеньковых бактерийЮ-2 Н для применения в качестве средства для получения удобрения под нут. Штамм изучен на сортах нута, районированных в почвенно-климатических условиях ЮгоВосточного Казахстана. В последнее время во всем мире активно набирают популярность микробиологические препараты для растениеводства, в том числе и бактериальные удобрения. Бактериальные удобрения позволяют воспользоваться естественным потенциалом природы для улучшения минерального питания и защиты растений. Удобрения на основе азотфиксирующих микроорганизмов являются наиболее распространенном типом бактериальных удобрений. Симбиотическая азотфиксация является дополнительным источником азотного питания растений,благодаря чему повышается продуктивность растениеводства, сохраняются и пополняются запасы почвенного азота, снижаются затраты на минеральные удобрения. Особенностью бобовых является способность обеспечивать себя азотом за счет симбиоза с клубеньковыми бактериями,превращающими атмосферный азот в формы, доступные для минерального питания растений. В свою очередь,корневые и пожнивные остатки бобовых служат богатым источником азотного питания и для сельскохозяйственных культур, возделываемых вслед за ними на этом поле 1. Известен штамм клубеньковых бактерий нута.522 для промышленного производства бактериальных препаратов под нут. Штамм депонирован и хранится в коллекции ВНИИСХМ (Патент 1128545, кл. С 05 11/08,опубликовано 30.05.85). Известен ряд штаммов клубеньковых бактерий для промышленного производства бактериальных препаратов под нут, описанных в патентах,например штамм производства Всероссийского НИИ микробиологии для повышения урожайности и сбора белка при возделывании нута (Патент 2477942, кл. А 01 С 1/06, А 01 С 1/08, опубликовано 27.03.13). Их недостатком является то, что указанные штаммы отбирались и испытывались на сортах нута,культивируемых в России, применительно к местным почвенно-климатическим условиям. При этом отсутствуют данные по эффективности этих штаммов в почвенно-климатических условиях основных регионов культивирования нута в Казахстане. Задачей заявляемого изобретения является выявление нового штамма клубеньковых бактерий с высокой азотфиксирующей активностью,пригодного для получения бактериального препарата под нут, адаптированного для почв 2 Южного Казахстана с целью повышения урожайности нута. Указанная задача решается за счет того, что для удобрения под нут используется штамм клубеньковых бактерийЮ-2 Н. Штамм бактерий был выделен из клубеньков нута, произрастающего на опытном участке НИИ КИЗ Алматинской области. Штамм депонирован в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН Республики Казахстан (коллекционный номер ИМиВ 22 от 27.08.2014) и предназначен для получения бактериального препарата под нут с высокой азотфиксирующей активностью клубеньковых бактерий. Штамм Ю-2 Н характеризуется следующими морфологокультуральными и физиолого-биохимическими признаками. Морфологические и культуральные признаки. Образует на среде с бобовым отваром полупрозрачные, приподнятые, слизистые колонии,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,40,6 см. Физиологические признаки. Штамм является аэробом,растет в температурном интервале 15-35 С, температурный оптимум 26-28 С при рН 6-7. Оптимум рН 7,0-7,2. Рост на МПА слабый.Ю-2 Н растет на средах, состав которых приведен в таблице 1. Штамм Ю-2 Н идентифицирован по Определителю Берги (2009) как штамм вида. Изобретение поясняется следующими примерами. Пример 1 Проведен подбор оптимальной среды для роста штаммаЮ-2 Н. ШтаммЮ-2 Н выращивают на рекомендованных для роста клубеньковых бактерий средах. Результаты опытов представлены в табл. 1. ШтаммЮ-2 Н инкубировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 200 мл среды в течении 48 часов на орбитальном шейкере при 180-200 об/мин и температуре 281 С. Оптимальной для роста штаммаЮ-2 Н является среда с бобовым отваром, на которой титр клеток достигает 6,10,19 х 109 КОЕ/мл. Наиболее высокий титр клеток (2,10,23 х 1010 КОЕ/мл) наблюдается на этой среде при использовании сахарозы в концентрации 8,0 г/л. Разработан оптимальный вариант модифицированной среды с бобовым отваром для роста и максимального накопления биомассы штамма клубеньковых бактерий нутаЮ-2 Н (титр клеток 2,10,23 х 1010 КОЕ/мл),состава, г/л Н 2 Р 4 - 1,0 4720 - 0,3 сахароза - 8,0 горох -507,0. Пример 2 Конкурентоспособность клубеньковых бактерий нутаЮ-2 Н определяли методом генетического маркирования. Исследуемые штаммы ризобий культивировали на минеральнорастительной среде (МРС) с возрастающими (от 20 до 1000 ед/мл) дозами антибиотика (стрептомицина или канамицина). Полученные резистентные варианты использовали для проведения вегетационных исследований. На каждый вариант вегетационного опыта сеяли по 100 штук семян. Для исследования использовали сорт нута Икарда. Перед инокуляцией семена стерилизовали смесью этанола и перекиси водорода (11) и промывали трехкратно стерильной водой. Клубеньки, взятые с корней бобовых растений, в возрасте не менее 5 недель, стерилизовали и помещали в стерильную чашку Петри с водой. В стерильные чашки Петри предварительно разливали среду МРС (минеральнорастительная среда) без антибиотика и, отдельно,такую же среду, но с 1000 ед. стрептомицина на мл среды. Состав среды МРС, (г/л) 2 НР 4 - 0,5 Н 2 Р 4 - 0,5 472 - 0,1 4 - 0,10,2 (4)672442 - следы маннит или глюкоза - 20,0 соевая мука - 10,06,8-7,0. На 2 чашки Петри со стрептомицином (1000 ед/мл) и 1 чашку без антибиотика (контроль) стерильно пинцетом размещали клубеньки и раздавливали,делая поверхностный мазок. Предварительно под чашки Петри подкладывали расчерченные шаблоны на 25 гнезд. Итого на одной чашке анализировали 25 клубеньков. Инкубирование исследуемых чашек проводили в течение 7-10 дней. С одного варианта анализировали по 50 клубеньков. После этого подсчитывали количество клубеньков, давших рост клубеньковых бактерий на обычной среде и среде со стрептомицином. Результаты рассчитывали по следующей формуле КС 100/0. Величину конкурентной способности выражали в процентах. Результаты опытов приведены в таблице 3. Конкурентная способность клубеньковых бактерий штаммаЮ-2 Н равна 25,7. Пример 3 Азотфиксирующую активность штаммаЮ-2 Н изучали ацетиленовым методом. Клубеньковые бактерии выращивали на агаровой среде следующего состава, (г/л) КН 2 РО 4 - 1,0 472 - 0,3 сахароза - 2,0 бобовый отвар 50,07,0. Микроорганизмы выращивали в закрытых ватными пробками флаконах. Для инициации роста добавляли минимальное количество источника связанного азота (0,00010,005 дрожжевого экстракта). В конце инкубационного периода ватную пробку заменяли стерильной пенициллиновой пробкой. Газообразный ацетилен собирали в вытяжном шкафу следующим образом. В пробирку, наполовину заполненную 15 мл воды, добавляли небольшое количество (около 1 г) карбида кальция. Пробирку закрывали пробкой с отверстием, через которое она с помощью резиновой трубки соединялась с химическим стаканом с водой. Ацетилен вводили в сосуд с культурой через резиновую пробку до концентрации 10 (по объему). Через различные промежутки времени инкубации отбирали пробы газа по 1 мл из сосуда с культурой и проверяли наличие этилена методом газовой хроматографии. Азотфиксирующую активность определяли по восстановлению ацетилена в этилен методом газовой хроматографии на хроматографе марки 7697 А. Величину нитрогеназной активности выражали в нмоль С 2 Н 4/ч/1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Результаты опытов приведены в таблице 3. Азотфиксирующая активность штаммаЮ-2 Н составляет 12,0 нмоль С 2 Н 4/ч/1 млн. клеток клубеньковых бактерий. Таким образом, штаммЮ 2 Н может быть использован для получения бактериального препарата под нут, адаптированного для почв Казахстана. Штамм проявляет высокий уровень роста на модифицированной среде с бобовым отваром и активно фиксирует атмосферный азот. Таблица 1 Среды для роста и накопления биомассы штамма клубеньковых бактерий нутаЮ-2 Н Питательные среды Исварана Лазарева Среда с бобовым отваром Среда с кукурузным экстрактом Грэхема Фреда Норриса МРС Мазэ Минимальная среда Титр клеток, КОЕ/мл Морфологические признаки колоний 2,50,14107 Полупрозрачные, приподнятые,слизистые, округлые с ровными краями,5,80,15105 диаметр колоний 0,3-0,7 см 6,10,19109 2,30,16105 2,50,22107 6,20,21105 2,50,16105 9,90,11107 6,40,10107 2,60,10104 Таблица 2 Влияние источников углерода на рост и накопление биомассы штаммаЮ-2 Н Углеводы Сахароза Морфологические признаки колоний Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,3-0,6 см Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,3-0,6 см Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,3-0,6 см Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,3-0,6 см Полупрозрачные, приподнятые, слизистые,округлые с ровными краями диаметр колоний 0,3-0,6 см Таблица 3 Азотфиксирующая активность и конкурентоспособность штамма клубеньковых бактерий нутаЮ-2 Н Штамм клубеньковых бактерийЮ-2 Н Нитрогеназная активность, нмоль С 2 Н 4/ч/ 1 млн. клеток клубеньковых бактерий 14,50,12 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм клубеньковых бактерийЮ-2 Н, депонированный в коллекции РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК под регистрационным номером ИМиВ 22,используемый в качестве средства для получения бактериального препарата под нут.