Способ определения эндогенных и экзогенных маркеров крови

(51) 01 33/48 (2006.01) 01 33/50 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2012/0919.1 21.08.2012 17.08.2015, бюл. 8 Гареев Рауф Ахметович 16018 , 15.07.200517280 , 14.04.200616019 , 15.07.2005 Левченков С.И. Физическая и коллоидная химия. Конспект лекций для студентов биофака ЮФУ///// 2. Физиология крови. Методическое пособие к практическим занятиям по нормальной физиологии(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МАРКЕРОВ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине и медикобиологическим исследованиям, а именно к определению в крови самых различных эндогенных и экзогенных маркеров переносимых в плазме, а также на поверхности клеток крови. Способ заключается в подготовке к анализу раствора с субстанциями, плазмы крови плюс те субстанции, которые в цельной крови находились в адсорбированном слое (были адсорбированы) на поверхности форменных элементов крови. Он отличается тем, что в цельную (исходную) пробу крови добавляются вещества, способствующие переходу в плазму крови субстанций,адсорбированных на поверхности клеток крови. В качестве основного варианта рекомендуется добавлять гипертонический раствор хлористого натрия или определенное количество сухой соли хлористого натрия. Способ предназначен для анализа в крови всех ныне определяемых эндогенных и экзогенных субстанций, но в первую очередь онкомаркеров,иммуномаркеров, маркеров допингового контроля,которые транспортируются в крови преимущественно на поверхности клеток крови, а также для проведения фармакологических исследований. Изобретение относится к медицине и медикобиологическим исследованиям, а именно к определению в крови онкомаркеров и маркеров других заболеваний, гормонов и ферментов,маркеров допингового контроля и иммуноглобулинового статуса, к тестам на образование комплексов антиген-антитело, к проведению ПЦР диагностики, а также к фармакодинамическим и фармакокинетическим и другим исследованиям. Уровень техники Общеизвестно значение лабораторных методов исследования состояния человека, актуальность выявления маркеров допингового контроля на олимпийских играх и других спортивных соревнованиях международного уровня,необходимость более точного выявления влияния фармакологических препаратов на организм человека, более ранней диагностики онкологических заболеваний и т.д. В лабораторных анализах и научных медико-биологических исследованиях содержание биомаркеров в крови определяется по их концентрации в плазме крови. Аналог, его критика Однако в этих лабораторных методах исследования имеются также и проблемы. К примеру, некоторые допинги практически не определяются в плазме крови. Поэтому о них судят лишь по их метаболитам в моче или в луковицах волос (.,, .5, 3, 2008 и др.). Онкомаркеры достоверно определяются нередко лишь на поздних стадиях заболевания. Некоторые хронические инфекционные и паразитарные заболевания не всегда выявляются при тестах на образование комплексов антигенантитело. Механизм и первопричина аллергических и аутоиммунных процессов не всегда ясны по данным определения иммуноглобулинов. Некоторые из перечисленных проблем непосредственно связаны с выявленным нами комплексом свойств эритроцитов, которые по аналогии с газотранспортной функцией, были названы адсорбционно-транспортной функцией эритроцитов. Наши исследования показали, что многие биомаркеры переносятся преимущественно на поверхности форменных элементов крови. Эти адсорбированные на поверхности клеток крови субстанции транспортируются непосредственно в обменный слой кровеносных капилляров, далее они в первую очередь участвуют в транскапиллярном и тканевом обмене. Доля таких (вне плазмы) биомаркеров в целом согласуется с важностью их для регуляторных, защитных или регенерационных процессов в организме. По многим биомаркерам показатели транспорта их на поверхности эритроцитов более информативны,чем используемые в практике данные об их содержании в плазме крови (Гареев Р.А. Некоторые итоги исследований и перспективы изучения адсорбционно-транспортной функции эритроцитов. Вестник КазНУ, серия биологическая, 2 (44),2010, с.103-109. 2.. 1, 2011, . 5-10). По нашим данным, стресс сбрасывает многие вещества с поверхности форменных элементов крови в плазму. Поэтому содержание некоторых биомаркеров в плазме крови может варьировать в широких пределах. Показатель суммарного содержания каждой определенной субстанции в плазме и среди адсорбированных на форменных элементах крови веществ, как правило, имеет существенно (в 1,5-2 раза) меньший коэффициент вариации, чем соответствующий показатель только по плазме. Известны способы выделения в раствор субстанций, адсорбированных на поверхности эритроцитов (Гареев Р.А., Предварительные патенты РК 16018, 16019, 17280 и др.). Однако предложенные способы не унифицированы,имеют двух и более этапные схемы выделения в анализируемые растворы субстанций, находившихся в крови на поверхности эритроцитов. Поскольку среди форменных элементов крови на 2-3 порядка по численности преобладают эритроциты, субстанции, адсорбированные на поверхности форменных элементов крови, мы чаще обозначаем как эритроцитоадсорбированные вещества(вещества,адсорбированные на поверхности эритроцитов,или субстанции эритроцитоадсорбированного пула). Такое обозначение базируется также на том, что способы вышеуказанных предпатентов, позволяют получать для анализа лишь субстанции, адсорбированные исключительно на поверхности эритроцитов. При этом субстанции, адсорбированные на поверхности лейкоцитов,не попадают в раствор,подготавливаемый для анализа. Способы вышеуказанных предпатентов не учитывают также изменение объема эритроцитарной массы в процессе удаления эритроцитоадсорбированных субстанций в элюат (смывной раствор) или в плазму. Сущность изобретения Предлагается во всех необходимых исследованиях, где сейчас применяется плазма(сыворотка) крови, использовать субстрат со всеми внеклеточными маркерами крови (маркеры плазмы плюс маркеры переносимые на поверхности клеток крови). Для этого предлагается способ одноэтапного удаления адсорбированных на эритроцитах и лейкоцитах биомаркеров в плазму (или в смесь плазмы с приливаемым раствором и фильтратом из клеток) для получения пробы с суммарным содержанием всех внеклеточных маркеров крови. Эта смесь маркеров плазмы и удаленных с поверхности клеток крови маркеров является биоматериалом для определения ферментов,гормональных и других регуляторов организма,маркеров заболеваний и иммунодефицита,субстратом для проведения тестов на образование комплексов антиген-антитело, ПЦР реакции, для выявления экзогенных субстанций и метаболитов при допинговом контроле, а также при фармакодинамических и фармакокинетических исследованиях и т.д. Сведения,подтверждающие возможность осуществления патента От стандартных методов отмывки клеток крови предлагаемый способ отличается по ряду особенностей. Он основан на дополнительном эффекте отмывки, связанном с фильтрацией части внутриклеточной воды. Выход внутриклеточной воды с уменьшением объема эритроцитов и лейкоцитов наблюдается из-за увеличения внеклеточного осмотического давления при добавлении в кровь соли или гипертонического солевого раствора. Осмотическое давление приливаемого раствора зависит от концентрации и свойств находящихся в растворе солей. Хлористый натрий почти не имеет противопоказаний для последующих анализов. Концентрация приливаемого гипертонического раствораможет быть в диапазоне 2-6. Резистентность эритроцитов к гипертоническим растворам непостоянна, особенно она вариабельна у больных и пожилых людей. Поэтому в качестве стандарта мы рекомендуем использовать 4 раствор. В этом случае гемолиз наблюдается относительно редко. Объем приливаемого к крови гипертонического раствора зависит от чувствительности намечаемого метода анализа. Чем выше разведение крови приливаемым раствором,тем ниже будет концентрация биомаркеров в анализируемом субстрате. Вариант добавки сухого порошка хлористого натрия в пробу крови требует осторожного перемешивания. Более приемлем вариант, когда проба крови пропускается через трубку с дозированным содержанием соли на внутренней стенке. Возможны варианты с тест-полосками. В отдельных специальных исследованиях возможна отмывка с использованием раствора крупномолекулярных соединений, повышающих онкотическое давление крови. В других специальных исследованиях можно использовать вещества, например, гормоны стресса (адреналин и др.), которые также способствуют переходу в плазму адсорбированных на клетках крови субстанций. В качестве выбора предлагается также двухэтапный вариант,когда после центрифугирования забирается вся плазма, вместо плазмы в эритроцитарную массу добавляется гипертонический раствор,эритроциты и добавленный раствор перемешиваются, смесь вновь центрифугируется. Во всех этих случаях учитывается разведение исходного объема плазмы добавляемым раствором и водой, которая выходит из клеток крови после добавления гипертонического раствора или соли. Для более точных поправок определяют гематокрит исходной крови и гематокрит крови после добавления вещества, способствующего переходу в плазму субстанций адсорбированных на эритроцитах. По этим гематокритам рассчитывают поправку на объем эритроцитарной массы и объем плазмы с приливаемым раствором. Пример. Один мл крови смешивался с 1 мл 4 раствора хлористого натрия . Смесь центрифугировалась. В надосадочной жидкости(супернатанте) с использованием стандартного биуретового метода белок был выявлен в концентрации 31 г/л. Гематокритвенозной крови был равен 45, соответственно объем плазмы составлял 55 или 0,55 мл в 1 мл крови. К этому объему плазмы в пробе крови был добавлен 1 мл 4 раствора . В этом гипертоническом растворе объем эритроцитарной массы сжался на треть (на 0,15 мл). Таким образом, по сравнению с исходной пробой крови новый объем плазмы (0,55 мл плазмы, плюс 1 мл 4 раствора , плюс 0,15 мл вышедшей из эритроцитов воды) увеличился в 3,09 раза (0,551,00,15/0,553,09). На этот коэффициент разведения умножаем цифру концентрации белка в супернатанте (31 г/л), получая (313,0995,79). Концентрация белка в плазме равнялась 65 г/л,разница (95,79-6530,75) - это белок, находившийся на поверхности форменных элементов крови. Расчеты вообще не являются объектом патентования. Однако необходимо отметить, что суммарное содержание какого-либо внеклеточного маркера крови правильнее рассчитывать на единицу объема крови, а не на единицу объема плазмы. В этом случае получаемый показатель меньше зависит от приема пищи, стресса, обезвоживания и многих других воздействий и состояний. При добавлении к единице объема крови трех (и более) объемов гипертонического раствора можно пренебречь долей объема эритроцитарной массы в смеси. Расчет упрощается. К примеру, получили 14,3 г/л белка в надосадочном растворе. Умножили 14,3 на суммарный объем крови и приливаемого (134) раствора (14,3457,2), получили 57,2 г/л в расчете на единицу (л) объема крови. Если эту цифру сжать до начального (0,55) объема плазмы, то получим (57,2/0,55104 г/л) 104 г/л. Это (104) больше 95,79 лишь на 8,6. На серийные исследования необходимо выводить свой поправочный коэффициент. Способ предназначен для анализа в крови всех ныне определяемых эндогенных и экзогенных субстанций, но в первую очередь онкомаркеров,иммуномаркеров, маркеров допингового контроля,переносимых в крови преимущественно на поверхности клеток крови, а также для проведения фармакологических исследований. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения эндогенных и экзогенных маркеров крови, отличающийся тем, что в цельную кровь добавляют соль или гипертонический раствор,вызывающий усиление перехода в плазму крови субстанций, адсорбированных на поверхности клеток крови.