Способ оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности F1 семян подсолнечника

(51)01 1/04 (2010.01) 12 1/68 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ и семеноводству перекрестно - опыляемых культур, в том числе подсолнечнику. Задача изобретения - повышение разрешающей способности, точности и надежности способа оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности 1 семян гибридов подсолнечника. Альбумины (гелиантинины) семян подсолнечника извлекают фосфатным буфером рН 6,8, содержащим восстановители дисульфидных связей ( меркаптоэтанол), фракционируют в щелочной среде(ПААГ 12 концентрации), полученные белковые спектры семян линий сравнивают со стандартными,оценивают типичность и чистоту линий, у исходной отцовской формы простого или трехлинейного гибрида выявляют компонент, не характерный для материнской формы, по его присутствию в спектре белка выявляют гетерозиготные (гибридные) семена и рассчитывают уровень гибридности 1 семян.(72) Булатова Кульпаш Мансуровна Юсаева Дамира Анарбековна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский Научнопроизводственный центр земледелия и растениеводства(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТИПИЧНОСТИ И ЧИСТОТЫ САМООПЫЛЕННЫХ ЛИНИЙ И УРОВНЯ ГИБРИДНОСТИ 1 СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА Изобретение Способ оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности 1 семян подсолнечника относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетике, селекции и семеноводству перекрестно - опыляемых культур,в том числе и подсолнечнику. Использование традиционных методов определения подлинности (типичности) семян сельскохозяйственных культур, основанных на грунт- контроле не дает желаемых результатов. Эти методы основаны на визуальной оценке морфологических признаков семян,которые могут модифицироваться в той или иной мере в зависимости от условий возделывания. В действующем ГОСТ 9576-84 Семена подсолнечника. Сортовые и посевные качества. Технические условия предусматривается только за стерильностью материнских линий, генетическая чистота и гетерозиготность гибридов вообще никак не лимитирована. В авторском свидетельстве 1800670 предлагается решать проблему качества семян подсолнечника лабораторным методом,основанным на полиморфизме запасного белка семени подсолнечника - гелиантинина, выявляемого электрофорезом в кислой системе В спектре белков,фракционированных согласно описанию в кислой системе электрофореза, к информативной зоне относится область быстроподвижных компонентов, различия в которой могут быть обусловлены как разной концентрацией белка, связанной с процедурой выделения так и присутствием белков другой природы и не отражать истинные показатели семян линий и гибридов подсолнечника. Для оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян 1 подсолнечника согласно патенту России 2294965 предлагается использовать электрофоретические спектры амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции фрагментов (микросателлитных локусов) ДНК проростков отдельных семян. На настоящий момент эти методы не стандартизированы,дорогостоящи и не имеют широкого применения в селекции и семеноводстве. Кроме того, не все полиморфные амплификации наследуются по кодоминантному типу, что ограничивает возможности метода. Существует Способ определения чистоты и гибридности семян подсолнечника - А.с. СССР 1750509 основанный на электрофоретическом разделении белков ферментов эстераз,катализирующих реакции расщепления сложных эфиров,содержащихся в семенах подсолнечника (прототип). Чистота материала характеризуется типичностью изоферментных спектров эстераз различных семян конкретной линии, гибридность семян определяется по наличию в их белковом спектре характерных для отцовской и материнской форм аллеломорфов фермента. Метод имеет ряд ограничений 1.Ферментные системы семян могут изменять свою активность в зависимости от сроков и условий хранения, в связи с чем интерпретация результатов анализа может быть неадекватной истинному состоянию уровня чистоты линий и гетерозиготности семян. 2. Число изоформ в спектре и аллеломорфность ферментов ниже гетерогенности и полиморфности запасных белков, что приводит к сходству значительного числа линий по картине электрофореграмм (у прототипа 5 линий из 7 имеют один тип эстеразных электрофореграмм), что приводит к непригодности данного метода для определения гибридности семян ряда гибридов (у прототипа уровень гибридности гибрида Одесский 128 данным методом определить нельзя). Задача изобретения - повышение разрешающей способности, точности и надежности способа оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности 1 семян гибридов подсолнечника. Поставленная задача достигается предлагаемым нами способом оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности 1 семян подсолнечника,который позволяет анализировать стабильный, более полиморфный и гетерогенный запасной белок семян альбуминового класса (гелиантинин), пуфем его экстракции фосфатным буфером в присутствии меркаптоэтанола и получения стабильных электрофоретических спектров с четким проявлением более 30 полипептидов гелиантинина,включающих специфические, т.е. характерные для родительских линий. Чистоту и типичность самоопыленных линий и уровень гибридности семян простого или трехлинейного гибрида оценивают анализом электрофореграмм гелиантинина единичных семян, выявлением и подсчетом нетипичных семян у линий и гетерозиготных(гибридных) семян у гибридов подсолнечника. Пример осуществления способа. Выделение гелиантининов ведут из очищенного и расколотого на несколько частей ядра семени 0,05 М фосфатным буфером с рН 7, содержащим 0.5 додецилсульфата натрия (ДДС ), 5- меркаптоэтанола, 10 глицерина, 0,1 красителя бромфенолового синего в объеме 0.26 мл. на пробу. После 2-х часовой экстракции белков пробу алкилируют акриламидом,прогревают на кипящей водяной баре 2 минуты и,после охлаждения, наносят в объеме 20-25 мл на 1 гелевый карман 12 полиакриламидного геля,разделяющая часть которого имеет размеры 115 мм х 90 мм х 1 мм, а концентрирующая 115 мм х 20 мм х 1 мм. Ввиду простоты процедуры экстракции сокращаются сроки анализа. Система разделения соответствует методу Лэммли (1970), за исключением соотношения компонентов в составе электродных буферов верхний буфер содержит 0,025 трис и 0,0192 М глицин (рН 8,3), додецилсульфата натрия -0,01, нижний буфер 0,005 М трис и 0,0038 М глицин (рН-8,3) (7). Разделение проводит при силе тока 60 мА до выхода красителя бромфенолового синего. Фиксацию и окрашивание белковых полос проводят в 12,5 растворе трихлоруксусной Кислоты, содержащем 0,04 красителя кумасси бриллиантового голубого промывают проточной водой и заливают 7 уксусной кислотой для обесцвечивания фона. Компоненты спектра регистрируют по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП). Типичность и чистоту самоопыленных линий определяют сравнением электрофореграмм оцениваемых линий и стандартных образцов соответствующих линий. Чистоту) самоопыленной линии вычисляют по формуле ЧГх 100/, где Ч -чистота линии, Г - число семян,соответствующих по спектру гелиантинина стандартному образцу,- общее число анализированных семян. Определение уровня гибридности семян 1 простого гибрида подсолнечника ведут путем сопоставления электрофореграмм гелиантинина индивидуальных анализированных семян со спектром запасного белка отцовской и материнской линий. В нашем примере анализировали семянки простого гибрида подсолнечника Казахстанский 1(рисунок), материнская форма которой (ВКУ 102 А) не имеет в спектре гелиантинина компонент с ОЭП 33, который имеется, напротив, в белковом спектре отцовской формы ВКУ 41 В (на рисунке указан стрелкой). Семена, в спектре которых выявляется один или несколько специфических компонентов отцовской формы, не перекрываемых компонентами материнской формы, относят к гетерозиготным по белоккодирующим локусам, т.е. гибридным (в нашем случае семена под 1,2,7-11 на рисунке). Линия ВКУ 41 В является отцовской формой и для гибридов Солнечный 20, Казахстанский 5. Характерными,не перекрываемыми компонентами материнской формы в спектре гибридных семян являются полосы гелиантинина отцовской линии с ОЭП 76 и 46, соответственно.(Уровень гибридности семян первого поколения(1) определяют по формуле УГГ 00/ , где УГ уровень гибридности , Г -число гибридных семян, шт.,-общее число анализированных семян. Таблица Состав запасных белков семян простого гибрида Казахстанский 1 и его исходных родительских форм 94 2 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки типичности и чистоты самоопыленных линий и уровня гибридности 1 семян подсолнечника, включающий извлечение белков из семян подсолнечника, электрофорез белковых проб и оценку типичности и чистоты линий по результатам анализа полученных спектров, а также уровня гибридности семян простого или трехлинейного гибрида по наличию в белковом спектре характерных для отцовской 2 1 формы компонентов, отличающийся тем, что анализуют стабильный, более полиморфный и гетерогенный запасной белок семян подсолнечника альбуминового класса (гелиантинин), который извлекают из семян фосфатным буфером рН 6,8,содержащим восстановитель дисульфидных связей