Способ Н. Алибаева и О. Бекетауова отбора жизнеспособных эмбрионов каракульских овец для трансплантации

(51) 01 67/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ Н. АЛИБАЕВА И О. БЕКЕТАУОВА ОТБОРА ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ЭМБРИОНОВ КАРАКУЛЬСКИХ ОВЕЦ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ(57) Изобретение относится к трансплантации эмбрионов, в частности к отбору жизнеспособных эмбрионов, извлеченных у суперовулированных каракульских овцематок-доноров после индукции их гормональным препаратом. Целью изобретения является дифференциация одновозрастных эмбрионов по темпу дробления клеточных масс и разработка критериев их отбора для трансплантации, гарантирующих высокий уровень приживляемости. Способ позволяет повысить интенсивность воспроизводства исчезающих и редких генотипов каракульских овец в 1,6 раза больше по сравнению с традиционным способом.(72) Алибаев Нуррадин Бекетауов Орынбек Есеркепова Зауре Ауганбаевна Калгимбаева Мариям Адильбековна Байтореев Келдибек Кузербайулы Алибаева Эльмира Тураковна Бекетауова Дина Орынбековна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Юго-Западный научноисследовательский институт животноводства и растениеводства(56)10835 А, 15.11.200118595 , 16.07.20072032338 С 1, 10.04.19952142283 С 1, 10.12.1999 Разработка биотехнологических и иммуногенетических методов создания высокопродуктивных типов каракульских овец. Отчет о НИР / КазНИИ каракулевод. ЦАИ РК, 23605 Изобретение относится к трансплантации эмбрионов, в частности к отбору жизнеспособных эмбрионов, извлеченных у суперовулированных каракульских овцематок-доноров после индукции их гормональным препаратом. Известен способ классификации эмбрионов по морфологическим признакам (Инструкции по технологии работы организации по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, МСХ РФ, М.,-2000.с.100-103), включающий оценку качества и определение стадии развития эмбрионов. При этом в зависимости от стадии их развития эмбрионы подразделяют на 2-12 клеточные, ранние морулы,включающие 12-36 бластомер,морулы,включающие 33-64 бластомер, бластоцисты,включающие 65- 130 бластомер и расширенные бластоцисты, включающие 130-200 бластомер. Данная оценка эмбрионов по стадиям развития,применяемая в биотехнологии трансплантации, как классификация биологической полноценности эмбрионов, не может быть надежным критерием оценки их жизнеспособности, так как от каждого суперовулированного донора получают эмбрионы на разных стадиях развития с разным числом клеточных масс от неоплодотворенной яйцеклетки до расширенной бластоцисты,при этом вариабельность извлеченной эмбриопродукции в зависимости от дня их извлечения колеблется в пределах от 5,0 до 58,4, и самое главное при данном способе не учитывается степень дробления клеточных масс каждого вымытого эмбриона в популяциях одновозрастных эмбрионов, что существенно снижает точность выявления жизнеспособных эмбрионов для пересадки. Целью изобретения является дифференциация одновозрастных эмбрионов по темпу дробления клеточных масс и разработка критериев их отбора для трансплантации, гарантирующих высокий уровень приживляемости. Пример. Для исследований использованы 386 штук одновозрастных эмбрионов, вымытых в разные сроки после осеменения доноров (таблица 1). Через 24-30 часов после осеменения доноров стадия развития извлеченных эмбрионов колебалась от одноклеточных до 4-х клеточных. На вторые сутки после осеменения вариабельность одновозрастных эмбрионов колебалась от 2 клеточных до 12-клеточных, на третьи - от 6 клеточных до морул ранних, на четвертые - от 10 клеточных до морул поздних и на пятые - от морул ранних до ранних бластоцист. Таблица 1 Частоты встречаемости эмбрионов с разными стадиями развития в зависимости от дня их извлечения Время извлечения эмбрионов, ч Всего,Показатели шт. 24-30 48 72 96 120 Всего изучено 50 60 88 99 89 386 эмбрионов, шт. В.т.ч. по стадиям развития, в 1 -клеточные 28,06,3 14 2-клеточные 50,07,1 6,73,2 29 4- клеточные 22,05,8 18,35,0 22 6-клеточные 30,05,0 5,72,5 23 8-клеточные 21,75,5 13,63,6 25 10- клеточные 10,03,9 23,94,5 5,02,2 32 12-клеточные 13,34,4 29,54,9 10,12,6 44 Морула ранняя 27,34,7 55,65,0 31,54,9 107 Морула поздняя 29,34,6 58,45,2 81 Бластоциста ранняя 10,13,2 9 Учитывая эмбрионов Дифференциация одновозрастных эмбрионов в зависимости от стадии их развития клеточная масса Время извлечения эмбрионов, ч 24-30 48 72 96 120 2 Степень дробления клеточных масс эмбрионов высокая средняя 4 2 10-12 6-8 морулы ранние 10-12 морулы поздние морулы ранние бластоцисты ранние морулы поздние 23605 При этом основные параметры дифференциации эмбрионов по степени их развития следующие эмбрионы, извлеченные через день после осеменения доноров, клеточная масса которых составляла не менее четырех относили к высокому статусу, к среднему - 2-х клеточные и низкому одноклеточные двухдневных эмбрионов - высокие 10 и 12 клеточные,средние - 6 - 8 клеточные, низкие - 2 - 4 клеточные трехдневных эмбрионов - высокие морулы ранние, средние - 10 и 12 клеточные,низкие - 6 и 8 клеточные четырехдневных эмбрионов - высокие - морулы поздние,средние - морулы ранние, низкие - 8 и 12 клеточные и пятидневных эмбрионов - высокие бластоцисты ранние средние - морулы поздние,низкие - морулы ранние соответственно. Установлено, что с ускорением темпа дробления клеточных масс одновозрастных эмбрионов их качество эмбрионов повышается на статистически достоверную величину. В группе эмбрионов с ускоренным темпом дробления клеточных масс,число эмбрионов с морфологической оценкой отлично и хорошо было максимально больше 93,2. Среди эмбрионов со средней интенсивностью развития данный показатель снизился на 27,0, возросло число эмбрионов удовлетворительного качества до 20,0 и дегенерированных эмбрионов на 13,8 (таблица 3). В группе эмбрионов с низким темпом дробления отсутствовали эмбрионы с оценкой отлично,снизился процент эмбрионов хорошего качества до 34,8 и увеличилось число удовлетворительных и дегенерированных эмбрионов на 29,2 и 36,0 соответственно. Полученные данные подтверждают необходимость строгой эмбриоселекции извлеченных эмбрионов по степени их развития. Таблица 3 Качество эмбрионов в зависимости от их статуса Статус эмбрионов Низкий Средний Высокий Всего При пересадке эмбрионов с высоким статусом развития суягность овец-реципиентов составила 62,5, эмбрионов со средним статусом - 55,6 и с низким статусом - 27,8. В среднем, Качество эмбрионов,хорошее удовлетворительное 34,85,0 29,24,8 45,23,4 20,02,8 59,95,2 6,92,7 46,12,5 19,22,0 приживляемость эмбрионов составила 51,75,3 Приживляемость эмбрионов с разными статусами развития Показатели Число пересаженных эмбрионов, шт. Число реципиентов, гол Получено ягнят-трансплантатов, гол Процент приживляемости эмбрионов В сравнительном аспекте разница по приживляемости между эмбрионами с высокой и средней степенью дробления клеточных масс была недостоверной (Р 0,05) и достоверной у эмбрионов 1-2 и 3 групп (Р 0,01), что свидетельствует о влиянии темпа развития эмбрионов на их приживляемость после пересадки. Методом трансплантации эмбрионов доноров каракульских овец с учетом темпа дробления клеточных масс получено 45 голов ягняттрансплантатов. Изучение изменчивости живой массы ягняттрансплантатов при рождении и отбивке показало,что ягнята, полученные от пересадки эмбрионов с высокими и средними статусами развития как при рождении, так и в 4,5-месячном возрасте, обладали Статус эмбрионов средний низкий 45 18 45 18 25 5 55,67,4 27,810,5 большими преимуществами в росте и развитии по сравнению с ягнятами, полученными от пересадок эмбрионов с низким статусом развития. Превосходство по живой массе животных 1 и 2 групп над контрольными аналогами 3 группы составило при рождении в пределах от 8,0 до 20,6, при отбивке от 17,5 до 56,6. Полученная разница по живой массе высокодостоверна(Р 0,001). Внедрение разработанного способа в технологию трансплантации эмбрионов позволит повысить интенсивность воспроизводства исчезающих и редких генотипов каракульских овец в 1,6 раза больше по сравнению с традиционным способом. В частности позволяет упростить технику и точность отбора жизнеспособных эмбрионов повысить 3 23605 приживляемость пересаженных эмбрионов на 10,8 повысить рентабельность биотехнологии воспроизводства каракульских овец от 17,4 до 58,3. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ отбора жизнеспособных эмбрионов для трансплантации,включающий морфологическую оценку качества и стадии развития эмбрионов, отличающийся тем, что дополнительно дифференцируют свежеполученные эмбрионы доноров по степени дробления клеточных масс в зависимости от дня их извлечения на высокие, средние и низкие темпы развития и для пересадки реципиентам отбирают те эмбрионы, у которых степень дробления клеточных масс не ниже средней. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что подразделены темпы развития эмбрионов извлеченные через 24-30 часов после осеменения доноров высокие - не менее 4-х клеток, средние - 2 х и низкие - одноклеточные 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что подразделены темпы развития двухдневных эмбрионов высокие - 10-12 клеточные, средние - 68 клеточные и низкие - 2-4 клеточные 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что подразделены темпы развития трехдневных эмбрионов высокие - морулы ранние, средние - 1012 клеточные, низкие - 6-8 клеточные 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что подразделены темпы развития четырехдневных эмбрионов высокие - морулы поздние, средние морулы ранние, низкие - 8-12 клеточные 6. Способ по п.1. отличающийся тем, что подразделены темпы развития пятидневных эмбрионов высокие - ранние бластоцисты, средниеморулы поздние и низкие - морулы ранние