Способ двухступенчатой оценки жаростойкости зерновых

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к селекции и семеноводству. Целью настоящего изобретения является повышение надежности и эффективности оценочных работ в селекции и семеноводстве. Способ осуществляют путем определения концентрации свободного пролина (1 этап) и активности катодных изопероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 100 (2 этап) в проростках опытных и контрольных растений и сопоставления данных испытуемых образцов с соответствующими показателями биологического стандарта. Способ повышает эффективность создания новых сортов зерновых с высокими показателями устойчивости к стрессовым условиям возделывания.(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт земледелия и растениеводства(56)476858, 15.07.19751186144 А, 23.10.19851701193 А 1, 30.12.1991 Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям. Методическое руководство,Ленинград, 1988(54) СПОСОБ ДВУХСТУПЕНЧАТОЙ ОЦЕНКИ ЖАРОСТОЙКОСТИ ЗЕРНОВЫХ 22833 Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к селекции и семеноводству, и может быть использовано научными учреждениями при выведении новых сортов зерновых с высокими показателями устойчивости к стрессовым условиям возделывания. Известен способ определения жаростойкости растений 1, аналог, основанный на измерении пределов транспирации нижней и верхней сторон листа, по разности которых судят о пределах жаростойкости. Способ комплексного определения жаро- и засухоустойчивости растений 2, аналог включает в себя как оценку засухоустойчивости, так и жаростойкости растений, не разграничивая эти свойства растительного организма. В качестве биологического показателя при данном способе используется толщина листа а оценку степени устойчивости проводят по величине отношения толщины листа после и до воздействия на растения повышенной температурой или обезвоживанием. Известен способ оценки жаростойкости растений 3, прототип по воздействию на тканевой экстракт прогревания в течение 2-х часов при температуре 25-65-85 С с последующим определением активности суммарной пероксидазы или ее компонентов. Существенным недостатком данного способа является полное игнорирование растительного объекта как целостной биологической системы. При прогревании тканевого экстракта вне связи с целым растением нарушаются все естественные регуляторные функции генотипа и в этом случае можно судить не о жаростойкости растений как генетической системы, а о термостабильности некоторых изопероксидаз. Более того, в тканевой экстракт не могут попасть так называемые адаптивные изоформы пероксидазы, т.е. те изопероксидазы, которые синтезируются живым растением в ответ на стрессовое воздействие высокой температуры. При сравнении устойчивости растительных объектов к стрессам,в т.ч. и к высокотемпературному, необходимо проводить оценку на материале одинакового возраста,поскольку устойчивость любого организма количественно изменяется в онтогенезе 4. В прототипе не учитывается возрастная выравненность образцов. К недостаткам прототипа следует отнести и низкую пропускную способность способа, что важно для селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к стрессам, поскольку это требует оценки значительного объема исходного и гибридного материала. Для этого целесообразно применять принцип поэтапной оценки,с проведением первичной оценки всего количества изучаемых объектов с помощью одного из наиболее производительных и простых методов, что дает возможность сравнительно быстро выявлять наиболее устойчивые образцы. Изменения водно-осмотического режима в клетках растений наиболее тесно связаны с 2 устойчивостью к засухе и жаростойкостью. Аккумуляция в тканях растений свободного пролина в условиях стресса улучшает водный режим, оводненность биополимеров, обеспечивает стабильность функционирования антиоксидантных ферментов, в том числе и пероксидазы. Протекторная роль экзогенного пролина используется в способах защиты растений от засухи 5 и высокотемпературного стресса 6. В этой связи в предлагаемом нами способе двухступенчатой оценки жаростойкости зерновых отбор основывается на показателе осмотического потенциала тканей - концентрации свободного пролина и стабильности биополимеров реактивности элемента пероксидазного комплекса. Заявляемый способ повышает надежность и эффективность оценочных работ по дифференциации сортов,коллекционных и селекционных номеров и линий с-х. растений по устойчивости к высокотемпературному стрессу. Это достигается тем,что партии проростков испытуемых образцов и биологического стандарта,относительно которого ведется оценка, делят на две части, на одну из которых воздействуют высокой температурой,определяют концентрацию свободного пролина и активность изопероксидазы с относительной электрофоретической подвижностью(ОЭП) 100 опытных и контрольных растений, после каждой оценочной операции бракуют генотипы и окончательно, по активности изопероксидазы судят о жаростойкости испытуемых образцов. Существенный признак прототипа, общий для него и заявляемого объекта исследования измерение относительной активности пероксидазы у контрольных и опытных растений в процессе оценки испытуемых генотипов- воздействие высокой температурой в качестве стрессового фактора. Предлагаемый способ отличается от прототипа- воздействие стрессового фактора направлено на живые, одновозрастные растения (проростки)- используется биологический (селекционный) стандарт, относительно которого ведут оценку- выявление (оценка) жаростойких форм осуществляется ступенчато по двум биохимическим показателям. Пример 1 1 часть 12-ти дневных проростков испытуемых образцов ячменя и биологического стандарта,выращенных в чашках Петри на многослойной фильтровальной подложке при ежедневном поливе в лабораторных условиях (20-23 С), подвергают воздействию температурного стресса создаваемого в камере с освещением (лампа накаливания 500 вт) при наращивании температуры до 55-58 С и сохранении ее на этом уровне в течение 1 часа. Другую часть проростков используют в качестве контроля. Из контрольных и опытных образцов берут по 2 навески в 1 и 0,5 граммов, первую гомогенизируют в 10 мл 3-х процентной сульфосалициловой кислоты и фильтруют через мелкопористый бумажный фильтр (экстракт 1), вторую гомогенизируют на 22833 холоде с 3,5 мл трис-глицинового буфера рН 8,3,содержащего 40 сахарозы,гомогенат центрифугируют при 7000 в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают и хранят на холоде (экстракт 2). 1 мл экстракта 1 переносят в пробирку с притертой пробкой, к содержимому приливают 1 мл 3 процентной сульфосалициловой кислоты, 2 мл кислого нингидрина (1,25 г нингидрина растворяют в смеси 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл 6 М фосфорной кислоты) и 2 мл уксусной кислоты. Пробирку с реактивной смесью плотно закрывают пробкой, помещают в водяную баню и выдерживают при температуре 100 С 1 час. Реакцию останавливают охлаждением,в пробирку приливают 4 мл толуола, встряхивают содержимое 15 секунд, отстаивают в течение 15 минут, верхнюю прозрачную жидкость сливают в кювету, просматривают на ФЭКе при длине волны 520 нм. По калибровочной кривой определяют содержание свободного пролина в контрольных и опытных образцах, рассчитывают кратность его возрастания в опытном образце. Генотипы с интенсивностью накопления свободного пролина не ниже чем у биологического стандарта, отбирают для следующей ступени оценки жаростойкости(таблица 1). Таблица 1 Оценка жаростойкости сортообразцов ячменя по интенсивности накопления свободного пролина в проростках (1-я ступень оценки) Содержание свободного пролина (в О Генотипы мг/ на сырую массу) оставленные для Контрольные Опытные растения К дальнейшей оценки растения (К) 11. Сауле 34,6 216,3 6,2 12. Унумли Арпа 5,1 34,2 6,7 Экстракт 2 из контрольных и опытных прибор для электрофореза, наносят на гель экстракт образцов биологического стандарта и генотипов,в объеме 0,020-0,030 мкл, заполняют верхний и прошедшихступень оценки исследуют методом нижний резервуары прибора для электрофореза катодного электрофореза в 7,5 полиакриламидном буферным раствором геле (ПААГ) в трисглициновом буфере рН 8,3. Трис-(оксиметил)-аминометан 2,4 г Полиакриламидный гель формируют из трех Глицин 11,52 г растворов Вода дистиллированная до 4 л А Длительность катодного электрофореза 2 часа 15 Метиленбисакриламид 0,08 г минут при силе тока 4 мА на трубку. Первые 20 Акриламид 3 г минут разделение проводят при силе тока 1,5 мА на Трис-(оксиметил)-аминометан 0,1 г трубку. Выявление изозимов пероксидазы в геле Глицин 0,48 г проводят 0,02 раствором бензидина Вода дистиллированная до 30 мл солянокислого и 0,1 раствором перекиси В водорода. Относительную активность Персульфат аммония 0,075 г индивидуальной изоформы пероксидазы Вода дистиллированная до 10 мл определяют путем замера в секундах времени ее С проявления с момента переноса гелевого столбика ТЕМЕД (11111 - тетраметилэтилендиамин), из бензидинового реагента в раствор перекиси который добавляют по 0,02 мл в смесь растворов А водорода и последующего расчета ее в процентах(4,5 мл) и В (1,5 мл). задержки всех изоформ. О жаростойкости Цилиндрические гели формируют в стеклянных сортообразца судят по стабильности изоформы трубках длиной 80 мм и диаметром 6 мм, пероксидазы с ОЭП 100. Образец, у которого укрепленных вертикально в держателе. Смесью относительная активность изоформы с ОЭП 100 в растворов А, В и С заполняют трубки на высоту спектре опытного экстракта не превышает 70 мм., сверху осторожно наслаивают электродный относительную активность аналогичной изоформы в буфер для создания ровной поверхности гелевого контрольном варианте, считают жаростойким,столбика. По окончании полимеризации (табл.2) поверхность гелей осушают, укрепляют трубки в 3 22833 Таблица 2 Оценка сортообразцов ярового ячменя по характеру изменчивости относительной активности изопероксидазы с ОЭП 100 (2-я ступень оценки) Наименование испытуемого образца 16 Д-221105-3 М 10/83-6 Дон 8-1 23910-01 Сауле Унумли Арпа Относительная активность ок Выявленные изопероксидазы с ОЭП 100 жаростойкие формы контрольные опытные растения (К) растения (О) 5,8 8,2 1,4 6,3 6,3 1,0 Источники информации 1. А.с. СССР 476858 Способ определения жаростойкости растений. Л.Н.Бабушкин,опубликовано 15.07.1975, бюллетень 26, с. 6. 2. А.с. СССР 1186144 Способ комплексного определения жарои засухоустойчивости растений. М.Д.Кушниренко,А.А.Штефырца,С.Н.Печерская,А.И.Ротарь,С.И.Баштовая,В.Н.Жолкевич и Г.А.Молдован, опубликовано 23.10.1985, бюллетень 39, с.13. 3. А.с.1701193 Способ оценки жаростойкости растений. А.А.Грушин и А.П. Ивакин,опубликовано 30.12.91. Бюл.48. 4. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям(методическое руководство), 1988, Ленинград, 228 с. 5. Патент РФ 22392 Способ защиты растений от засухи. Стаценко А.П., Ткачук О.А., Орлов А.Н.,Надежкин СМ., опубликовано 10.11.2004. 6. Патент РФ 2253223 Способ защиты растений от высокотемпературного стресса. Мелихов В.В., Панфилова О.Н., Каренгина Т.В.,опубликовано 10.06.2005 Бюл.1 Способ двухступенчатой оценки жаростойкости зерновых, преимущественно ячменя, включающий измерение биохимических показателей, воздействие высокой температурой, отличающийся тем, что проростки подвергают в камере с освещением лампой накаливания в 500 вт воздействию температурой (55 - 58 С) в течение часа, другую партию растений (контрольная) оставляют при температуре 20 - 23 С, в половине обеих партий проростков определяют концентрацию свободного пролила и по соотношению интенсивностей прироста свободного пролина производят первичную браковку генотипов, у второй части не выбракованных генотипов определяют относительную активность катодной изопероксидазы с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 100 и генотипы у которых соотношение активностей изопероксидазы с ОЭП 100 опытных и контрольных растений ниже единицы, относят к жаростойким, а генотипы с показателями выше единицы, но ниже показателя стандартного генотипа относят к перспективным жаростойким формам.