Способ получения вакцины против сибирской язвы животных

(12 1/20, 12 107) (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ при изготовлении вакцины против сибирской язвы животных. Задачей изобретения является создание способа изготовления вакцины против сибирской язвы животных, позволяющего упростить процесс приготовления вакцины,увеличить выход спорового материала, исключить наличие большого количества вредных химических веществ в вакцине и уменьшить риск получения брака в больших объемах. Способ получения вакцины против сибирской язвы животных включает культивирование штамма 55-ВНИИВиМ на твердой питательной среде,содержащей гидролизат мяса (перевар Хоттингера),соевый и картофельный гидролизат, дрожжевой экстракт, казеиновый пептон и дополнительно натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный,магний сернокислый, натрий хлористый и агар-агар. Преимуществом способа является упрощение процесса приготовления вакцины, увеличение выхода спорового материала, исключение вредных химических веществ в вакцине и уменьшение вероятности брака в больших объемах.(72) Сулейменова Мерует Амантаевна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Ахметсадыкова Шынар Нурлановна Ахметсадыкова Назия Нурлановна Амиргазиев Ералы Куанышбаевич(56)1837071 А 1, 30.08.1993 Диагностика особо опасных и малоизвестных инфекций. Издательство Ростовского университета, 1970, с.194-1951791449 , 30.01.1993(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ЖИВОТНЫХ 16379 Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к способу изготовления вакцины против сибирской язвы животных. Известен способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных,включающий культивирование сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в жидкой питательной среде, содержащей органический источник азота, до максимального образования спор с последующим концентрированием споровой культуры,отстаиванием смеси и отделением осадка, согласно изобретению, штамм 55-ВНИИВВиМ культивируют на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт сухой, пептон, калий фосфорнокислый двузамещенный, кальций хлористый, магний сернокислый,цинк сернокислый,медь сернокислую, железо сернокислое, аммоний сернокислый при следующем тношении компонентов,дрожжевой экстракт сухой 0,2-0,3 пептон ферментативный сухой 0,2-0,3 калий фосфорнокислый двузамещенный 0,04-0,06 кальций хлористый 0,004-0,006 магний сернокислый 0,03-0,05 цинк сернокислый 0,0005-0,0015 медь сернокислая 0,0005-0,0015 железо сернокислое 0,00005-0,00015 аммоний сернокислый 0,15-0,25 вода деминерализованная(рН 7,20,2) остальное,кроме того, культивирование осуществляют в реакторе в течение 23-25 ч, из них первые 17-19 ч при аэрации, поддерживая скорость растворения кислорода в среде (5,50,2) ммоль на 1 л среды в час, и для концентрирования бактериальных спор в качестве вспомогательного вещества используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, которую вносят в суспензию до конечной концентрации 0,20,3 , а отстаивание проводят при 0-25 С в течение 23-25 ч (патент 2095409, кл. 12 1/20, 3/00,А 61 К 39/07 // (12 1/20,С 12 107), 1997). Недостатком этого способа являются небольшой выход спорового материала (350-500 млн. спор в 1 см 3 питательной среды), наличие большого количества в питательной среде химических веществ, отрицательно влияющих на организм животного при вакцинации, сложность процесса изготовления вакцины, заключающаяся в аэрации воздухом, в кон-центрировании споровой культуры с последующим отстаиванием и отделением осадка. Кроме того, применение реакторов большого объема в производстве спорового материала может привести к большим объемам брака из-за возможных проростов питательной среды с культурой. Задачей изобретения является создание способа изготовления вакцины против сибирской язвы животных, позволяющего упростить процесс приготовления вакцины,увеличить выход спорового материала, исключить наличие большого количества вредных химических веществ в вакцине 2 и уменьшить риск получения брака в больших объемах. Это достигается тем, что в известном способе изготовления вакцины против сибирской язвы животных, включающем культивирование штамма 55-ВНИИВВиМ в питательной среде, содержащей деминерализованную воду, органический источник азота, до максимального образования спор, согласно изобретению, штамм 55-ИИиМ культивируют на твердой питательной среде, которая в качестве органического источника азота содержит гидролизат мяса (перевар Хоттингера), соевый и картофельный гидролизат, дрожжевой экстракт, казеиновый пептон и дополнительно натрий фосфорнокислый двузамещенный,калий фосфорно-кислый однозамещенный, магний сернокислый, натрий хлористый и агар-агар при следующем соотношении компонентов,соевый гидролизат 0,25-0,40 картофельный гидролизат 0,04-0,01 казеиновый пептон 0,005-0,01 гидролизат мяса 0,005-0,010 агар-агар 0,035-0,04 дрожжевой экстракт 0,001-0,002 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,0002-0,0004 натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,0005-0,001 магний сернокислый 0,0002-0,0004 натрий хлористый 0,3 деминерализованная вода(рН 7,2-7,4) остальное,с последующим смывом споровой культуры с твердой питательной среды забуференным физиологическим раствором с рН 7,2-7,4 и ее сбором. Упрощение процесса приготовления вакцины происходит за счет выращивания штамма 55 ВНИИВВиМ на твердой питательной среде, что исключает процесс аэрации и не требует дополнительного концентрирования вакцины. Кроме того, использование для выращивания штамма 55-ВНИИВВиМ обогащенной органическими соединениями питательной среды позволяет получить споровую культуру,содержащую 2,5-3,0 млрд. жизнеспособных спор в 1 см 3 без присутствия вредных химических веществ. Использование в технологии выращивания культуры сибирской язвы бутылей до 3 л ведет к меньшему числу проростов и выбраковок и получению качественной вакцины. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для изготовления основной серии производственного штамма берут одну ампулу с культурой в 30 -ном растворе глицерина, либо ампулу лиофилизированного штамма 55 ВНИИВВиМ предыдущей серии, которую разводят в 10 мл физиологического раствора. Суспензию спор высевают в пробирки с МПБ (мясопептонный бульон). Посевы инкубируют при 371 С в течение 20-24 часов. При наличии в пробирках с МПБ характерного роста в виде комочка ваты в 16379 прозрачном бульоне, либо в виде зонтика с легкой опалесценцией бульона, бульонную культуру высевают в питательную среду. Вторую стадию матричной расплодки проводят в 0,1 л флаконах. Готовят питательную среду, содержащую соевый гидролизат 0,25-0,40, картофельный гидролизат 0,04-0,01, казеиновый пептон - 0,005-0,01,гидролизат мяса - 0,005-0,010, агар-агар - 0,035-0,04,дрожжевой экстракт 0,001-0,002,калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,0002- 0,0004,натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,00050,001, магний сернокислый - 0,0002-0,0004, натрий хлористый - 0,3 и деминерализованную воду,разогревают до полного расплавления агар-агара,перемешивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4, разливают в 3 литровые бутыли по 250-300 мл и стерилизуют при температуре 1212 С в течение получаса. Бутылям со средой дают остыть до 50-60 С и обкатывают на роллере под струей холодной воды. Агар-агар застывает на стенках равномерным слоем. Готовую среду выдерживают 24 часа в термостате(термальной комнате) при 322 С для проверки на стерильность. Посевы инкубируют при 341 С в течение 4-5 суток. К этому времени спорообразование культуры достигает 80-100 . Процент спорообразования определяют путем выборочной микроскопии мазков. Смыв спор производят забуференным физиологическим раствором с рН 7,2-7,4 (200 мл в каждую бутыль) на роллере в течение 15-20 минут,споровую культуру штамма отсасывают в стеклянную посуду с бусами через сифон с марлевым фильтром. Смытую культуру шуттелируют в течение 1-1,5 часов, после чего из нее берут пробу для определения концентрации жизнеспособных спор, которая должна составлять 2,5-3,0 млрд. спор в 1 мл, и проверки ее на чистоту и типичность роста. Установленную проверкой чистую типичную,однородную суспензию, содержащую известное число спор, перемешивают мешалкой при 85 об/ мин, перекачивают в реактор объемом 630 или 1000 л, в котором находится расчетное количество буферного раствора нейтрального глицерина (рН 7,20,2), простерилизованного при температуре 1342 С в течение 1,5 часов, с расчетом получения концентрации, равной 20-25 млн. жизнеспособных спор в 1 мл, и массовой доли глицерина 30 . Приготовленную серию вакцины расфасовывают во флаконы емкостью 50-100 мл, закрывают их стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. На каждый флакон наклеивают этикетку, на которой указывают название вакцины, биопредприятия-изготовителя,номер серии и контроля, дату изготовления,годности препарата и дозы вакцины для животных разных видов. Флаконы вакцины хранят до окончания ее проверки в отделе биологического контроля при температуре от 2 до 15 С. Пример 1. Приготавливают посевной материал по прописи (см. выше). После чего готовят питательную среду, содержащую соевый гидролизат 0,25, картофельный гидролизат - 0,04, казеиновый пептон - 0,005, гидролизат мяса - 0,005, агар-агар 0,035, дрожжевой экстракт - 0,001, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,0002, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,0005, магний сернокислый - 0,0002, натрий хлористый - 0,3 и воду- остальное, нагревают до полного расплавления агар-агара, перемешивают, фильтруют через ватномарлевый фильтр, устанавливают рН 7,4-7,6. После этого разливают В трехлитровые бутыли по 250 мл и стерилизуют при температуре 1212 С в течение одного часа. Бутыли со средой охлаждают до 50-60 С, обкатывают на роллере под струй холодной воды, выдерживают 24 часа в термостате при плюс 322 С и высевают бульонную культуру в питательную среду. Посевы инкубируют при 351 С в течение 4-5 суток, определяют процент спорообразования, который должен быть не меньше 80-100 . Смыв спор производят забуференным физиологическим раствором с рН 7,2-7,4 (200 мл в каждую бутыль) на роллере в течение 15-20 минут. Споровую культуру штамма отсасывают в стеклянную посуду с бусами через сифон с марлевым фильтром. Смытую культуру шуттелируют в течение 1-1,5 часов, после чего из нее берут пробу для определения концентрации жизнеспособных спор, которая должна составлять не менее 2,5 млрд. спор в 1 см 3 и проверяют ее на чистоту. Пример 2. Способ осуществляется по примеру 1. Готовят питательную среду, содержащую соевый гидролизат 0,40, картофельный гидролизат - 0,01,казеиновый пептон - 0,01, гидролизат мяса - 0,010,аргар-агар - 0,04, дрожжевой экстракт - 0,002, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,0004, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,001, магний сернокислый - 0,0004, натрий хлористый - 0,3 и остальное - деминерализованную воду. После проведения технологического процесса количество жизнеспособных спор в культуре должно достигать не менее 3 млрд. спор в 1 см 3. Таким образом, использование в предлагаемом способе изготовления вакцины против сибирской язвы животных твердой питательной среды, простой в приготовлении и обогащенной органическими соединениями без добавления вредных химических веществ, позволяет значительно упростить процесс приготовления вакцины и получить споровую культуру,содержащую 2,5-3,0 млрд. жизнеспособных спор в 1 см 3 без присутствия вредных для здоровья животных химических веществ. Кроме того, применение в технологии выращивания культуры сибирской язвы бутылей до 3 л приводит к меньшему числу проростов и выбраковок и получению качественной вакцины. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения вакцины против сибирской язвы животных, включающий культивирование штамма 55-ВНИИВВиМ в питательной среде,содержащей деминерализованную воду,3 16379 органический источник азота в виде дрожжевого экстракта, до максимального образования спор,отличающийся тем, что штамм 55-НИИВВиМ культивируют на твердой питательной среде,которая в качестве органического источника азота дополнительно содержит соевый гидролизат,картофельный гидролизат, казеиновый пептон,гидролизат мяса,натрий фосфорнокислый двузамещенный,калий фосфорно-кислый однозамещенный, магний сернокислый, натрий хлористый и агар-агар при следующем соотношении компонентов,соевый гидролизат 0,25-0,40 картофельный гидролизат 0,01-0,04 казеиновый пептон 0,005-0,01 гидролизат мяса 0,005-0,010 агар-агар 0,035-0,04 дрожжевой экстракт 0,002-0,004 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,0002-0,0004 натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,0005-0,001 магний сернокислый 0,0002-0,0004 натрий хлористый 0,3 деминерализованная вода(рН 7,4-7,6) остальное,с последующим смывом споровой культуры с твердой питательной среды забуференным физиологическим раствором с рН 7,2-7,4 и ее сбором.