Способ серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

(51) 01 33/577 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности, к способу диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Способ серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты с последующим выявлением в сыворотках крови специфичных к возбудителю болезни антител с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов, при этом полистироловую планшету сенсибилизируют моноклональными антителами, специфичными к белку ППД-туберкулина с молекулярной массой 66 кД. Предложенный способ обеспечивает повышение специфичности ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.(72) Шенжанов Канат Толюбаевич Бакирова Гульнар Аманжоловна Булашев Айтбай Кабыкешович Ескендирова Сауле Зиядиновна(73) Акционерное общество Казахский государственный агротехнический университет им. С. Сейфуллина Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Ходун Л.М. и др. Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Приготовление реагентов тест-системы и методика постановки реакции // Методические рекомендации. Омск,1990, с. 13 Маслов Е.В., Бойко А.А. Оптимизация непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к// Ветеринария, 1986, 10, с.64-68 1780006 А 1, 07.12.1992 кл. 0133/535 (5) 1493953 А 1,15.07.1989 кл. 0133/53 (4) 14231 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Известен ряд методов серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота - РНГА, РДП и др., основанные на выявлении в сыворотке крови животного антител, специфичных к возбудителю болезни (Донченко А.С., Донченко В.Н. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей. Новосибирск,1994, с. 354). Недостатком приведенных серологических методов диагностики туберкулеза является их низкая чувствительность, а также высокий процент неспецифических результатов из-за отсутствия специфичного антигена. Одним из высокочувствительных и легковыполнимых аналитических тестов, используемых в иммунологии, является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Известен способ диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, включающий использование в качестве твердой фазы полистироловых планшет,сенсибилизированных ППД-туберкулином для млекопитающих (Маслов Е.В., Бойко А.А., Хорьков И.А. Оптимизация непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к// Ветеринария, 1986,10, с. 64-68) или белковой фракцией из клеточной стенки 8 (Ходун Л.М. и др. Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Приготовление реагентов тест-системы и методика постановки реакции // Методические рекомендации. Омск, 1990, с. 13) с последующим выявлением противотуберкулезных антител в сыворотке крови животных с помощью антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом. Однако ППД-туберкулин и белки клеточной стенки, применяемые в качестве сенситина в ИФА в своем составе, наряду со специфичными антигенными детерминантами, содержат и антигены, общие с микобактериями человеческого и птичьего видов, атипичными и паратуберкулезными микобактериями (Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. Будапешт, 1975, 365 с.),что не только снижает чувствительность, но и специфичность ИФА. Задачей изобретения является разработка способа серологической диагностики туберкулеза, повышающего специфичность ИФА при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Поставленная задача решается тем, что полистироловую планшету для иммуноферментного анализа сенсибилизируют моноклональными антителами,специфичными к белку ППД-туберкулина с молекулярной массой 66 кД, и инкубируют ППДтуберкулином, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота антител, специфичных к названному антигену, осуществляют с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают 2 оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови,средняя величина оптической плотности которых не менее 2,1 раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Готовят препаративное количество моноклональных антител. С этой целью ампулу с замороженными гибридными клетками вынимают из сосуда (СДС-30-1) с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды (4 С), отмывают один раз путем центрифугирования 5-7 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок клеток ресуспендируют в неполной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и вводят в дозе 2 х 106 клеток внутрибрюшинно мышам линии /, которым за 7-10 дней до введения гибридомы инъецируют пристан (2, 6, 10, 14 тетраметипентадекан) в дозе 0,5 мл на голову. После образования асцитной опухоли через 12-14 дней мышь забивают цервикальной дислокацией, фиксируют на подложке и препарирует кожу вдоль белой линии живота. Асцитную жидкость из брюшной полости собирают в центрифужные пробирки с помощью стерильного шприца с иглой. Затем асцитную жидкость центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут для отделения гибридных клеток. Надосадочную жидкость, содержащую моноклональные антитела, с помощью пипетки отбирают в отдельную посуду. Очистку моноклональных антител из асцитной жидкости осуществляют методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого асцитную жидкость сначала разбавляют равным объемом забуференного физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2), добавляют равный объем (/) насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при постоянном перемешивании 12 часов на магнитной мешалке при темепературе 4 С. Антитела отделяют путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 30 минут при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР с рН 7,2, переносят в диализную трубку и диализуют против ЗФР в течение 24 часов. Определяют концентрацию МКА в растворе по белку методом Брэдфорда. Очищенные моноклональные антитела в виде раствора хранят при 4 С с добавлением 0,1 азида натрия или в замороженном состоянии при -70 С без консерванта. Пример 2. Готовят конъюгат - комплекс, состоящий из кроличьих антител противкрупного рогатого скота и фермента пероксидазы хрена. С этой целью 4 мг пероксидазы хрена ( - 2,7-3,0) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перийодата натрия и осторожно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре. Приготовленный раствор фермента диализуют против 14231 0,001 М ацетатного буфера (рН 4,4) в течение 18 часов при температуре 4 С. Затем в полученный альдегидный раствор пероксидазы вносят 0,02 мл 0,2 М бикарбонатного буфера (рН 9,5) и сразу же прибавляют 8 мг аффинных антител (антител ккрупного рогатого скота) в 0,01 М бикарбонатном буфере (рН 9,5). Реакционную смесь выдерживают 2 ч в темноте при температуре 20 С, добавляют к ней 0,1 мл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия и оставляют на 2 часа при 4 С. Затем диализуют против боратного буфера (16-18 часов,4 С), прибавляют равный объем 60 глицерина в боратном буфере и хранят при 4 С. Определяют рабочий титр конъюгата методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение,которое выявляеткрупного рогатого скота в концентрации не ниже 20-40 нг/мл. Конъюгат считается пригодным для использования, если имеет рабочий титр не менее 1500. Пример 3. Определяют оптимальные параметры постановки ИФА для выявления противотуберкулезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. С этой целью в лунки планшет для иммунологических реакций вносят по 0,1 мл раствора моноклональных антител с концентрацией белка 0,02 мг/мл в 0,05 М бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6). Планшет закрывают крышкой и инкубируют 18 ч при 4 С. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и отмывают трехкратно по 1-2 мин, заполняя лунки до верхнего края ЗФР с 0,05 твином 20 (ЗФР-ТВ). В лунки планшета для блокирования свободных участков вносят по 0,1 мл 1 раствора бычьего сывороточного альбумина в ЗФР (рН 7,4) и инкубируют при температуре 37 С в течение 1 часа. Повторяют процедуру отмывки по вышеописанному способу. Готовят рабочее разведение ППД-туберкулина в ЗФР с концентрацией белка 0,02 мг/мл и вносят по 0,1 мл в лунки планшета. Планшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37 С в течение 1 часа. Повторяют процедуру отмывки. Готовят разведения 1400 контрольных (позитивной и отрицательной) и испытуемых сывороток в ЗФР-ТВ. Для этого в первый ряд чистых пробирок вносят по 0,45 мл, во второй - 0,45 мл и в третий по 0,3 мл ЗФР-ТВ. После этого в первый ряд пробирок вносят по 0,05 мл испытуемых и контрольных сывороток, тщательно перемешивают и переносят по 0,05 мл во второй ряд, тщательно перемешивают и переносят 0,1 мл в третий ряд. В третьем ряду пробирок получают разведение 1400. В 2 лунки планшета (А-1 и В-1) вносят по 0,1 мл разведенной 1400 контрольной позитивной сыворотки, в 2 лунки (С-1 и -1) вносят по 0,1 мл контрольной отрицательной сыворотки, в 4 лунки - Е-1,-1 (контроль конъюгата) и -, -1 (контроль субстрата) вносят по 0,1 мл ЗФР-ТВ. В остальные лунки планшета вносят по 0,1 мл испытуемых сывороток в разведении 1400 в двух повторах, т. е. каждую пробу сыворотки вносят в 2 лунки (всего 45 проб сывороток на одну планшету). Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 С. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и трехкратно отмывают вышеописанным способом. Во все лунки планшета, кроме лунок и -1, вносят по 0,1 мл рабочего раствора меченных ферментом антител противкрупного рогатого скота. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. Повторяют процедуру отмывки и во все лунки планшета вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) растворяют 0,01 г ортофенилендиамина и вносят 0,05 мл 33-36 -ной перикиси водорода. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в темном месте при комнатной температуре (22 2 ) в течение 30 мин. Реакцию останавливают после развития желтого окрашивания в лунках с положительным контролем путем внесения в каждую лунку планшета по 0,1 мл 2 М раствора серной кислоты. Остановка реакции характеризуется темно-коричневым окрашиванием субстратной смеси в лунках с контрольной позитивной сывороткой. Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной отрицательной сывороткой, контроля конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой не менее 0,8 о.е. Учет проводят путем измерения оптической плотности реакционной жидкости в лунках планшета на спектрофотометре(, ) при длине волны 492 нм. Результаты анализа сывороток крови крупного рогатого скота на туберкулез считают положительными, если среднее значение ОП исследуемого образца сыворотки (Р) превышает среднее значение ОП контрольной отрицательной сывороткине менее 2,1 раза (/). Пример 4. Специфичность предложенного способа диагностики туберкулеза крупного рогатого скота оценивают в сравнении с известными методами - аллергическим, патологоанатомическим, а также непрямым вариантом ИФА, в котором в качестве антигена используют ППД-туберкулин для млекопитающих. Аллергические исследования 849 голов крупного рогатого скота, принадлежащих неблагополучной ферме, показали, что на внутрикожное введение ППД-туберкулина реагируют 90 или 10,6 животных. Наличие противотуберкулезных антител в сыворотке крови по непрямому варианту ИФА с ППДтуберкулином выявлено у 50 голов (5,9 ), а по предлагаемому способу - у 22 животных (2,6 ). При этом у 21 животного диагноз на туберкулез установлен по всем использованным тестам, у 29 голов аллергическим и непрямым ИФА с ППДтуберкулином, у одной головы аллергически и предлагаемым способом. 3 14231 С целью определения специфичности предлагаемого способа диагностики туберкулеза проведен контрольный убой 12 животных с последующим па тологоанатомическим исследованием внутренних органов (см. таблицу). Таблица Изучение специфичности методов диагностики туберкулеза непрямой вариант ИФА ( -) Результаты исследований патологоанатомическое сэндвичисследование внутренних вариант органов ИФА ( -) Туберкулезные изменения в бронхиальных лимфоузлах Туберкулезные изменения в органах не обнаружены Туберкулезные изменения в бронхиальных лимфоузлах Туберкулезные изменения в органах не обнаружены Туберкулезные изменения в подчелюстных, околоушных, средостенных и бронхиальных лимфоузлах Актиномикозное поражение языка Из общего числа убитых животных диагноз на туберкулез подтвердился у 9 голов, во внутренних органах которых были обнаружены характерные туберкулезные изменения. При этом у последних диагноз на туберкулез был установлен прижизненно аллергическим методом, непрямым вариантом ИФА и предлагаемым способом. У 3 животных, в сыворотке крови которых не были обнаружены специфические антитела к возбудителю болезни предлагаемым способом, но реагировавших на туберкулез аллергически и в непрямом варианте ИФА, диагноз на туберкулез патологоанатомическими исследованиями не подтвердился. Таким образом, предложенный способ диагностики туберкулеза является более специфичным по сравнению с аллергическим методом и ИФА, который осуществляется в непрямом варианте с использованием в качестве антигена ППД-туберкулина для млекопитающих. Использование предлагаемого способа в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет более полного выявления инфицированных туберкулезом животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты с последующим выявлением в сыворотках крови специфичных к возбудителю болезни антител с помощью меченных ферментом антивидовых иммуноглобулинов, отличающийся тем, что полистироловую планшету сенсибилизируют моноклональными антителами, специфичными к белку ППД-туберкулина с молекулярной массой 66 кД.