Штамм бактерии Francisella tularensis mediaasiatica 240, аттенуированный, используемый для приготовления вакцины

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ биологии и может быть использовано для приготовления вакцины для иммунизации людей против туляремии. Предложен штамм бактерии 240, аттенуированный, используемый для приготовления вакцины. Заявленный штамм депонирован в коллекции музея живых культур Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева, регистрационный номер КА-29. Вакцина из штамма 240, аттенуированного со сниженной остаточной вирулентностью, стабильностью аттенуированных свойств и слабой реактогенностью, не уступает по иммуногенности традиционно используемой для вакцинации населения живой туляремийной вакцине голарктического подвида 15.(72) Айкимбаев Алим Масгутович Чимиров Орь Базаржанович Лухнова Лариса Юрьевна Темиралиева Гульнара Асанбаевна Куница Татьяна Николаевна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева(54) ШТАММ БАКТЕРИИ 240, АТТЕНУИРОВАННЫЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ(57) Изобретение относится к медицинской микро 12742 Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для приготовления вакцины для иммунизации против туляремии. В СНГ для вакцинации людей с 1943 года против туляремии используют вакцину, изготовленную из штамма 15 (Гайский Н.А. Туляремийная вирус-вакцина. 1948). Вакцинный штамм был получен из вирулентного, в результате аттенуации. Недостатком этой вакцины является ее реактогенность. После вакцинации часто отмечаются осложнения, проявляющиеся в повышении температуры, увеличении подмышечных лимфатических узлов, потери трудоспособности. Вакцина производится в России, не зарегистрирована в Казахстане. Известно, что для профилактики туляремии у людей предпочтительнее использовать вакцины, соответствующие по антигенной структуре возбудителю, циркулирующему в данном типе очага. Задачей изобретения является получение штамма туляремийного микроба, обладающего слабой реактогенностью, высокой иммуногенностью и стабильностью аттенуированных свойств. Штамм микроорганизмавыделен О.Б. Чимировым в апреле 1982 года от 50 экземпляров иксодовых клещей.(. ), собранных в тугайном очаге в среднем течении реки Чу, Жамбылской области, Мойынкумском районе, в 10 км восточнее поселка Кумузек в условиях полевого туляремийного эпидотряда. Заявленный штамм депонирован в коллекции музея живых культур Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева, регистрационный номер КА-29, 11 июня 1999 г. Номенклатурные данные КлассОтрядСемействоРодВид .(, 1966). Маркерные характеристики 1. Ферментирует глицерин 2. Обладает ферментом цитруллинуреидазой 3. 50 штамма 240, аттенуированного для белых мышей, составляет 2134 микробные клетки (м.к.) 4. Чувствителен к пенициллину, ампициллину,карбициллину. Культурально-морфологические свойства. Коккобактерии располагаются одиночно или группами,грамотрицательные не растут на мясо-пептонном бульоне и агаре на свернутой желточной среде растут в виде извилистого блестящего слизистого налета, на кровяном агаре газон имеет серовато-голубой оттенок блестящий слизистый. Биохимическая активность. Штамм обладает цитруллинуреидазной активностью, ферментируют глюкозу, мальтозу, маннозу, левулезу, глицерин, не ферментируют маннит, сахарозу и лактозу. Вирулентность для лабораторных животных 50 штамма 240,2 аттенуированного для белых мышей составляет 2134 м.к., для морских свинок - 10 млрд м.к. Иммуногенность. Иммунизированные морские свинки не погибают при подкожном заражении 1000 смертельных доз вирулентного штамма. Специфическая профилактика туляремии заключается в использовании для целей вакцинации живого аттенуированного штамма, обладающего полным антигенным комплексом и свойствами аллергена и утратившего вирулентность для человека,морских свинок, кроликов, при сохранении остаточной вирулентности для белых мышей. Полноценный вакцинный штамм должен вызывать гибель 30 белых мышей при заражении их дозами до 1 млн. микробных клеток и не вызывать гибели морских свинок при заражении их дозами в 500 млн. м.к. Остаточная вирулентность и иммуногенность являются основными показателями, определяющими ценность вакцинного штамма. Важнейшим критерием в характеристике живых ослабленных вакцинных штаммов является стабильность аттенуированных свойств. Критерием для суждения о пригодности туляремийного штамма в качестве вакцинного являются 1. Сохранение им остаточной вирулентности для белых мышей 2. Безвредность для морских свинок 3. Способность при парентеральном введении морским свинкам даже незначительных доз микробов обуславливать аллергическую перестройку, выявляемую в положительной внутрикожной реакции с тулярином 4. Приобретение животными невосприимчивости после введения 1000 микробных клеток ослабленного штамма к заражению 1000 вирулентной культуры. Заявляемый штамм отвечает этим требованиям. Аттенуация заявляемого штамма проведена на искусственных питательных средах путем выращивания культуры в жидкой питательной среде, содержащей пептон, , 2 О 4, цистеин, глюкозу, с добавлением дефибринированной крови кролика, а также с использованием иммунной сыворотки. Пассирование культуры этим способом на жидкой среде проведено многократно. В результате получена субкультура, значительно снизившая свою вирулентность по отношению к белым мышам и морским свинкам и обладающая иммуногенными свойствами. Штамм стабильный, хранится в высушенном состоянии, не изменяет свойства в течение трех лет наблюдения. Пример. Лиофильное высушивание вакцины проводят в аппарате КС-30. Бактериальную массу получают выращиванием маточной культуры аттенуированного туляремийного штамма среднеазиатского подвида 240 в матрацах на питательной среде с добавлением гемолизированной крови. Инкубацию посевов проводят в течение 48 часов при 37 С. Выращенную бактериальную массу смывают 0,9 физиологическим раствором (рН - 7,0-7,2), определяют концентрацию микробов. Полученную бактериальную массу разливают в ампулы в объеме 1-2 12742 мл. Лиофилизацию вакцины проводят при замораживании в течение 18 часов и сублимационном высушивании в течение 42 часов. Вакцину туляремийную живую сухую контролируют согласно Временной Фармокопейной статье(ВФС) - 42.14138-78 Вакцина туляремийная живая сухая. Готовый препарат отвечает требованиям документации растворяется в 0,80,2 мл дистиллированной воды в течение 3 минут. Растворимый препарат представляет собой гомогенную взвесь беловато-желтого цвета без осадка, рН - 7,0,остаточная влажность - 3,6 . Вакцина стерильна,безвредна для морских свинок. Жизнеспособность вакцины составляет 45 , термостабильность 6 ,концентрация - 10 млрд м.к./мл, остаточная влажность - 3,6 , что соответствует требованиям регламента. Лабораторные испытания живой туляремийной вакцины среднеазиатского подвида, изготовленной из аттенуированного штамма .240 проводят параллельно с коммерческой вакциной .15 согласно ВФС 42.14138-78 Вакцина туляремийная живая сухая. Подлинность Живая туляремийная вакцина среднеазиатского подвида, изготовленная из аттенуированного штамма .240 обладает типичными культурально-морфологическими свойствами,характерными для данного подвида расщепляет глицерин, глюкозу и галактозу, но не разлагает лактозу, сахарозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, мелибиозу, сорбозу, рафинозу, обладает цитруллинуреидазной активностью, не растет на мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном бульоне. Растворимость Живая туляремийная вакцина среднеазиатского подвида из штамма .240 растворяется в 0,80,2 мл дистиллированной воды в течение 3 минут. Прозрачность и цветность Растворенная вакцина представляет собой гомогенную взвесь беловато-желтого цвета без посторонних примесей, осадка или хлопка. Кислотность, щелочность рН живой туляремийной вакцины среднеазиатского подвида из штамма .240 составляет 6,97,0. Остаточная влажность Остаточная влажность живой туляремийной вакцины среднеазиатского подвида из штамма .240 составляет 3 . Специфическая безвредность Согласно ВФС 42.14138-78 Вакцина туляремийная живая сухая вакцинный штамм туляремийного микроба в дозе 5 млрд. не должен вызывать гибели морских свинок в течение 15 дней наблюдения. Для определения специфической безвредности туляремийную живую вакцину из штамма .240 в дозе 5 млрд. микробных клеток вводят подкожно в область внутренней стороны бедра 4-м морским свинкам. В качестве контрольно го в опыте используют вакцину голарктического подвида 15. На месте введения вакцины голарктического подвида 15 на 6 сутки у трех морских свинок образуются язвенные очаги размером 1,2 х 1,3 см,заживление которых проходит на 10 день. Общая реакция организма морских свинок выражается в незначительной вялости животных и умеренном увеличении региональных лимфоузлов. Все симптомы проходят на 12-14 сутки. У группы животных, иммунизированных туляремийной живой вакциной из штамма среднеазиатского подвида 240,патологические изменения на месте введения вакцины отмечаются только у двух морских свинок в виде незначительного воспалительного инфильтрата. Заживление воспалительного очага отмечается на 8-10 сутки. Прививаемость Прививаемость туляремийной живой вакцины из штамма среднезиатского подвида 240 изучают на морских свинках накожным втиранием оспопрививательным пером в область предварительно нанесенных насечек на участке депилированной кожи животного 200 млн. микробных клеток испытуемых штаммов. В опыте используют по 3 морские свинки на каждый штамм. Через 3 суток у животных, привитых живой туляремийной вакциной голарктического подвида 15 образуется в месте втирания взвеси инфильтрат, отмечается гиперемия размером 1,0 х 0,5 см. У животных, привитых туляремийной живой вакциной из штамма среднезиатского подвида 240, в месте втирания взвеси отмечается гиперемия размером 0,5 х 0,6 см. Все симптомы проходят на 9-12 сутки. Иммуногенность Морских свинок весом 400 г прививают накожно в дозе 20 млн. м.к. туляремийной живой вакциной из штамма среднезиатского подвида 240. Через 30 дней после иммунизации проводят заражение морских свинок 1000 вирулентным штаммом 253(1 -5 м.к.) В качестве контроля используют 3-х неиммунизированных морских свинок. Наблюдение за животными ведут в течение 30 суток. Контрольные неиммунизированные животные умирают в среднем на 5-6 сутки, тогда как иммунизированные животные остаются живыми в течение всего срока наблюдения. Аллергенные свойства Аллергическая реакция у белых мышей, иммунизированных аттенуированным штаммом туляремийного микроба 240 и вакциной Гайского изучается различными методами постановкой пробы с тулярином и реакцией лейкоцитолиза. Аллергические методы диагностики(накожная и внутрикожная туляриновые пробы). При иммунизации туляремийной живой вакциной из штамма среднеазиатского подвида 240 аллергическая реакция у животных обнаруживается с 3-5 дня, соответственно,изменяются и тесты, поставленные, что соответствует требованиям. У двух животных, иммунизированных .15 отмечается некроз ткани на месте введения тулярина, при иммунизации аттенуированным штаммом среднезиат 3 12742 ского подвида 240 аналогичная реакция отмечается у одного животного. Таким образом, результаты проверки специфической безвредности, прививаемости и иммуногенности аллергенных свойств туляремийной живой вакциной, изготовленной из аттенуированного штамма 240, в сравнении с контрольной вакциной, изготовленной из 15, показывают,что изготовленная вакцина отвечает требованиям,предъявляемым к вакцинам. Кроме того, вакцина,изготовленная из аттенуированного штамма средназиатского подвида 240, по всем показателям менее реактогенна, чем традиционно используемая для вакцинации населения живая туляремийная вакцина голарктического подвида 15. Иммуногенность их для лабораторных животных одинакова. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерии 240, аттенуированный (депонированный в музее живых культур Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций под номером КА-29), используемый для приготовления вакцины.