Штамм бактерий Streptococcus equi Ж-42, используемый для изготовления живой вакцины против мыта лошадей

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/46 (2006.01) МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ быть использовано для профилактики мыта лошадей, обусловленного. Штамм бактерийЖ-42,используемый для изготовления живой вакцины против мыта лошадей. ШтаммЖ-42 несет две мутации, каждая из которых обусловливает снижение вирулентности и обеспечивает стабильность остаточной вирулентности. Оптимальный уровень аттенуации обеспечивает высокую иммуногенность штамма в качестве живой вакцины. Генетические маркеры позволяют дифференцировать штамм Ж-42 от культур естественного происхождения.(72) Бияшев Кадыр Бияшевич Орынтаев Кайрат Биримтаевич Сарыбаева Динара Амангельдиевна Кошкимбаев Серик Сейдимханович Жуманов Кайрат Токсанбаевич Ж-42,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ МЫТА ЛОШАДЕЙ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для профилактики мыта лошадей,обусловленного. Мыт лошадей известен в течение длительного времени как причина острого заболевания верхних дыхательных путей у лошадей. Данное очень заразное заболевание характеризуется лихорадочным состоянием,слизисто-гнойными выделениями,лимфоденапатией и последующим абсцессом лимфоузлов головы и шеи. Набухание лимфоузлов часто настолько сильным, что дыхательные пути становятся непроходимыми. Это явление объясняет общее название удушье. Мыт лошадей вызывает значительный отход жеребят и может достигать до 7090 у восприимчивых популяций. По результатам проведенных нами исследований и по отчтным сведениям Комитета ветеринарии МСХ Республики Казахстан большинство хозяйств республики стационарно неблагополучны по указанному заболеванию, нанося значительный экономический ущерб хозяйствам. Ветеринарная практика до сих пор не располагает эффективными препаратами, предназначенными для профилактики и терапии этой болезни. Существующие методы профилактики и терапии мыта лошадей не дают желаемого эффекта. В этой связи разработка новых методов, средств лечения и специфической профилактика мыта лошадей представляет собой научный интерес и отвечает запросам практики. Известна инактивированная вакцина против мыта лошадей из штамма мытного стрептококка . Н 34 (2080381 РФ, авторы - М.П. Неустроев, К.П. Юров, Н.П. Тарабукина, А.А. Баишев,2080381 С 1,12 1/20, 61 39/09, 1997). Основным недостатком известной вакцины является недостаточная ее эффективность и сложная схема применения. Слабые иммуногенные свойства вакцины объясняется тем, что это убитая вакцина. Проблемой инактивированных вакцин является то, что при инактивации возбудителя утрачивается большая или меньшая часть его иммуногенной структуры под влиянием физико - химических воздействий на микробную клетку. Поэтому особенно важно, чтобы исходный материал для убитых вакцин содержал антиген в максимально высоких концентрациях. Отсюда необходимость введения больших доз,многократность прививок. Продолжительность иммунитета известной инактивированной вакцины против мыта лошадей из штамма мытного стрептококка . Н-34 относительна коротка,проводится повторная вакцинация животных через 6 месяцев. Из литературных источников и из наших данных известно, что когда лошади инфицируются естественным путем живым вирулентнымполевым штаммом, у них развивается длительный иммунитет. Это имеет место,даже когда инфекция проходит без клинически симптомов. Это означает, что в принципе вакцинация живым ослабленным штаммом имела бы сильное преимущество над вакцинацией обычно 2 используемыми инактивированными вакцинами. В настоящее время живой вакцины из ослабленного штаммав ветеринарной практике не имеется. Задача изобретения - получение штаммаЖ-42, обладающего высокой иммуногенностью и стабильностью аттенуации. ШтаммЖ-42 получен генетическим методом из исходного вирулентного штамма 36. Исходный штамм 36 вирулентный для мышей (50103 КОЕ) высеивали на чашки с агаром Хоттингера в концентрации 109 КОЕ. Чашки с агаром содержали 50 мкг/мл неамина и 50 мкг/мл рифампицина. Полученные мутанты с желаемым фенотипом 3 раза рассеивали на селективной среде с антибиотиками. Вирулентность выделенных клонов изучали в опытах на мышах при их внутрибрюшинном заражении. Мутанты с фенотипом 100 и 100 характеризуются снижением вирулентности на 5-6 порядков в отличие от мутантов, устойчивых к неамину и рифампицину (фенотип 200 и 200). Отобрали аттенуированный клон 42(50109), который являлся донорским штаммом в опытах трансдукции с использованием бактериофага Р 22. Показано, что передача каждой из мутаций,обуславливающих фенотип мутанта 42 , в исходный вирулентный штамм 36 приводит к снижению его вирулентности. Среди трансдуктантов, приобретших одновременно мутации,сообщающие резистентность к неамину и рифампицину отобран штаммЖ- 42. ШтаммЖ-42 депонирован в ГУ НЦМРЛДМВ АПК МСХ РК в лаборатории Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов под номером 04-42. ШтаммЖ-42 характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические признаки. В мазках из гноя имеет вид длинных извитых цепочек, а в мазках из культур-коротких цепочек. Размер 0,40-1,0 мкм. Неподвижен. Грамположителен,спор и капсул не образует. Культуральные свойства. Факультативный аэроб, растет на обычных питательных средах, но лучше на средах, содержащих сыворотки или крови лошади на кровяном агаре вызывает гемолиз. При выращивании в бульоне мытный стрептококк выделяет гемотоксин,лейкотоксин и агрессины. Физиолого-биохимические признаки. Диапазон температур роста 37-39 С, оптимальная температура 37 С. Оптимум 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют сорбит, маннит. Не разжижает желатин. Антигенная структура. Серогруппа С. Резистентность к антибиотикам. Устойчив к 100 мкг/мл неамина и 100 мкг/мл рифампицина. Вирулентность. При внутрибрюшинном заражении беспородных белых мышей 509.0- 0.1 (ПО МЕТОДУ Рида и Менча с величиной средней ошибки, вычисленной по формуле Пицци). Стабильность остаточной вирулентности. 10-кратный пассаж штамма Ж-42 через организм белых мышей выявляет сохранение уровня остаточной вирулентности и стабильности маркеров антибиотикорезистентности. Все изолированные из органов мышей после каждого пассажа субкультуры имеют примерно одинаковые показатели остаточной вирулентности 509.0- 0.1. Стабильность аттенуации и маркеров резистентности к антибиотикам у штамма Ж-42 определяли путем обработки штамма мутагеном нитрозогуанидином. Изучение указанных свойств у 10 клонов штамма, отобранных после такой обработки,выявило их сохранение на том же уровне, что и у необработанной культуры(509,00,1). Минимальная подавляющая концентрация неамина 50 мкг/мл, рифампицина 50 мкг/ мл). Генетический анализ безопасности штамма Ж-42,как вакцинного штамма. Генетическое изучение штаммаЖ-42,проведенное с использованием трансдуцирующего бактериофага Р 22, показало, что его фенотиц определяется наличием 2 (двух) независимых мутаций -А гене и вгене,детерминирующем резистентность к неамину и рифампицину,ведущих к повреждению рибосомальных белков 17 и 12, влияющая на правильность считывания генетической информации,т.е. происходит аттенуация. Изучение вирулентности полученных трансдуктантов при внутрибрюшинном заражении белых мышей выявило снижение ее клонов,которые приобрели как 2 мутации, сообщающие резистентность к неамину и рифампицину, так и каждую в отдельности. Присутствие в штаммеЖ-42 двух мутаций, каждая из которых может снижать вирулентные свойства, служит убедительным доказательством стабильности и безопасности вакцинного штамма Ж-42. Теоретическая частота обратной мутации одновременно по двум маркерам составляет примерно 10-20, хотя практически невозможно. Дифференциация вакцинного штаммаЖ-42 от культур естественного происхождения. ШтаммЖ-42 дифференцируется от культур естественного происхождения по резистентности к 2 антибиотикам - неамину(100 мкг/мл) и рифампицину (100 мкг/мл). Наличие генетических маркеров резистентности к антибиотикам позволяет дифференцировать штамм Ж 42 в лабораторных условиях на простых питательных средах в течение 16-20 часов от культур эпизоотического прототипа при подозрении на мыт лошадей. Безопасность штамма Ж-42. КультураЖ-42 не вызывает заболевания и гибели белых мышей при внутрибрюшинном введении 24-часовой культуры штамма Ж-42 в дозах 105, 107, 109 и 1010 КОЕ(509,00,1, методу Рида и Менча с величиной средней ошибки, вычисленной по формуле Пицци). Иммуногенность штамма Ж-42. Штамм обладает выраженной иммуногенностью для мышей, защищая 100 животных при иммунизации их дозой 103 КОЕ, 90 белых мышейдозой 104 КОЕ. ПРИМЕР 1. Живую вакцину из штаммаЖ-42 приготавливают путем выращивания в аппарате для культивирования микроорганизмов (АКМШ). Выращивание культуры в аппарате в течение 16-18 ч при 37-38 С с аэрацией,после чего производят смыв культуры средой для высушивания, содержащей желатин 1,5-2, сахарозу 10,7,4-8,0. После проверки полученной микробной массы на чистоту и типичность роста ее доводят до концентрации 1010 КОЕ в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную массу разливают во флаконы объемом 4,0 см 3, подвергают лиофильной сушке до получения сухого продукта - пробиотика. Сохраняют препарат при температуре 4-6 С. Срок годности 12 месяцев. Пример 2. Для изучения иммуногенности живой вакцины из штаммаЖ-42 бактериальную взвесь,приготовленную для высушивания, разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 109 КОЕ в 1 мл. Иммуногенность вакцинного штамма Ж-42 изучали на 2-х месячных жеребятах, путем однократной подкожной вакцинации животных в дозе 109 КОЕ. Спустя 24 часа всем опытным и контрольным животным вводили внутрибрюшинно вирулентную культуру 36 в оттитрованной смертельной дозе. Все подопытные животные выжили, при падеже контрольных. Таким образом, штаммЖ-42 отвечает всем требованиям, предьявляемым к вакцинным штаммам обладает высокой иммуногенностью для мышей и жеребят, безопасен для использования, стабилен по остаточной вирулентности, маркирован. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерийЖ-42,депонирован в ГУ Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии АПК МСХ РК в лаборатории Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов под номером 04-42, используемый для изготовления живой вакцины против мыта лошадей.