Способ подготовки фиксированных зоологических и ботанических обьектов к морфологическому исследованию

МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ нейтрализации опасных для здоровья фиксирующих жидкостей просветлении тканей и внутренних структур объекта возможности восстановления не только фиксированных, но и высушенных биологических объектов. Восстановление фиксированных объектов проводится следующим образом. Извлеченные из консерванта зоологические или ботанические объекты помещаются в 30-40-ный водный раствор карбамида на период от 5-10 минут для мелких зоологических объектов до 3-5 часов для грубых ботанических объектов, в зависимости от размеров объекта, химической природы и концентрации фиксатора - до полного естественного распрямления(которое и служит индикатором визуального контроля готовности объекта к исследованию). После процедуры исследования объекты можно помещать в тот же консервант, из которого они были извлечены, где они зафиксируются в расправленном виде. Аналогичным образом готовят к исследованию сухие объекты (высушенные мхи,грибы,лишайники, беспозвоночных, мумифицированные тушки и ткани позвоночных животных).(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Павлодарский государственный педагогический институт Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды Справочник. - М. Колос, 1983. с.208 с.195(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ФИКСИРОВАННЫХ ЗООЛОГИЧЕСКИХ И БОТАНИЧЕСКИХ ОБЬЕКТОВ К МОРФОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ(57) Изобретение относится к области биологии и музейного дела, в частности, к способам изготовления препаратов биологических объектов и их подготовки к исследованию. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в восстановлении естественного положения, формы, консистенции и размера зоологических и ботанических объектов,деформированных в процессе консервации Изобретение относится к области биологии и музейного дела, в частности, к способам изготовления препаратов биологических объектов и их подготовки к исследованию. Известен способ подготовки фиксированных экземпляров гельминтов к морфологическому исследованию,включающий извлечение из консерванта и помещение в просветляющую среду,в качестве которой используются глицерин,молочная кислота, их смеси или водные растворы Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды Справочник. - М. Колос, 1983. с.208, с.195. При этом отмечается, что консервированные гельминты просветляются слабее, чем свежие, а на просветление крупных экземпляров нематод уходит несколько дней. После определения вида гельминтов переносят из просветляющей среды в фиксирующую жидкость. Однако известный способ подготовки фиксированного объекта к морфологическому исследованию не предусматривает восстановления исходной формы, размеров и пространственного расположения частей фиксированного объекта,подвергшегося деформации и ставшего ригидным в результате действия консерванта. Кроме того,описанный способ применим лишь к узкому кругу зоологических объектов, тогда как существует необходимость подготовки к морфологическим и морфометрическим исследованиям различных фиксированных зоологических и ботанических объектов. Задачей изобретения является разработка способа преодоления деформации зоологических и ботанических объектов, фиксированных в любой консервирующей жидкости, с расправлением объекта в естественном положении, восстановлении естественной величины, формы и консистенции наружных и внутренних структур с целью подготовки экземпляра к анатомо-морфологическим и зоометрическим исследованиям. Для решения поставленной задачи предлагается помещать извлеченный из консерванта объект в 3040-ный раствор карбамида с экспозицией от нескольких минут до нескольких часов до обретения объектом естественного положения и формы. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в следующем 1) восстановление естественного положения,формы и размера зоологических и ботанических объектов,деформированных в процессе консервации 2) доведение объекта до естественной мягкой консистенции, свойственной большинству живых тканей, что облегчает и делает более точными измерения на макроуровне 3) нейтрализация или снижение концентрации многих опасных для здоровья фиксирующих жидкостей, что исключает возможность их поступления в организм аспирационным путем и негативного воздействия на кожу рук 4) полное или частичное просветление тканей и внутренних структур объекта,позволяющее 2 микроскопировать,измерять,изготавливать постоянные или временные микропрепараты,причем для мелких объектов просветление наступает через несколько минут, для крупных через 1-2 часа 5) мягкая консистенция облегчает прессование гельминтов и других мелких беспозвоночных между стеклами перед изготовлением микропрепарата 6) возможность возврата естественной формы и консистенции не только фиксированным, но и высушенным биологическим объектам. Восстановление размера и формы объекта достигается за счет быстрого насыщения тканей влагой, а также нейтрализации жестких фиксаторов(особенно формальдегида), уменьшения дубящего эффекта консервантов за счет разрушения карбамидом межмолекулярных комплексов белков. Просветление достигается за счет оптических свойств молекулы карбамида. Нейтрализация многих широко использующихся консервантов достигается за счет химических и физико-химических свойств карбамида (амида угольной кислоты). Взаимодействие карбамида с формальдегидом дает либо метилмочевину (по уравнению 1), либо диметилмочевину (уравнение 2) Ледяная уксусная кислота (которая используется в качестве самостоятельной фиксирующей и просветляющей среды или входит в состав смесей( ). - . ., 1984, 6,4. - 251-253.. - . ., 1984, 6, 4. 242-245) приводит к гидролизу мочевины, после которого углекислый газ удаляется, а аммиак либо удаляется, либо связывается угольной кислотой и превращается в ацетат аммония(2)2 НОН 23 С 2 3 СН 3 СООН 34 (ацетат аммония). Этиловый и метиловый спирт смешиваются с водой в любых соотношениях, легко растворяют карбамид, за счет чего консервант быстро выходит из тканей объекта по градиенту концентрации. Восстановление фиксированных объектов проводится следующим образом. Извлеченные из консерванта зоологические или ботанические объекты помещаются в 30-40-ный водный раствор карбамида на период от нескольких минут до 3-5 и более часов - в зависимости от размеров объекта,химической природы и концентрации фиксатора до полного естественного распрямления (которое и служит индикатором визуального контроля готовности объекта к исследованию). Аналогичным образом готовят к исследованию сухие объекты (высушенные мхи,грибы,лишайники, беспозвоночных, мумифицированные тушки и ткани позвоночных животных). После процедуры исследования объекты можно помещать в тот же консервант, из которого они были извлечены, где они зафиксируются в расправленном виде. Результаты испытаний предлагаемого способа подготовки фиксированных объектов к морфологическому исследованию оказались следующими. Пример 1. Нематодыиз кишечника остромордой лягушки (длина 9-16 мм,толщина 0,15-0,25 мм) после фиксации и длительного хранения в 80-градусном этиловом спирте подверглись значительной деформации, что затрудняло измерение. Через 10-15 минут после помещения в 35-ный раствор карбамида нематоды полностью распрямились, все внутренние структуры гельминтов были хорошо видны под стереоскопическим микроскопом (МБС-10). Для нематод того же вида, фиксированных в 10-ном формалине,для полного распрямления и достижения оптической прозрачности потребовалось 15-20 минут. Измерение проводилось в течение 30 минут, деструкции червей не наблюдалось. После зоометрических исследований гельминты были помещены в те же консервирующие жидкости, в которых хранились ранее, где зафиксировались в расправленном виде(полностью прямыми). Пример 2. Трематодыиз кишечного тракта ииз легких остромордой лягушки были извлечены из соответствующих органов амфибий, хранившихся до вскрытия в 80-ном этиловом спирте в холодильнике. Плоские черви были деформированными, особенно гаплометры, которые образуют в легких лягушек агрегации и фиксируются в скрученной позе. Половозрелые О. от остромордой лягушки в Павлодарской области имеют длину 1-3 мм, ширину 0,3-0,6 мм. Обычные размеры . - 4-8 мм длины и 0,7-2 мм ширины. После помещения в 30-ный раствор карбамида кишечные трематоды О. расправились и достигли полного просветления уже через 4-5 минут и были готовы для морфометрических исследований. Экспозиция в карбамиде более 20 минут приводила к необратимой деструкции и лизису гельминтов с нежными наружными структурами и мелкими размерами тела. Более крупные легочные трематоды . хорошо расправлялись и просветлялись через 6-10 минут их экспозиция в крепких растворах карбамида более 30 минут нежелательна - в связи с повреждениями тегумента и даже внутренних структур. После работы трематоды были зафиксированы в расправленном виде в 70-градусном этаноле. Пример 3. Легкие кролика хранились более 6 лет в 10-ном формалине, стали ригидными и подверглись значительной деформации. После извлечения из консерванта были помещены в 40 ный раствор карбамида. Через 40 минут ригидность тканей уменьшилась, через 2 ч. легкие приобрели естественную консистенцию, их ткани стали прозрачными, что облегчило исследование кусочков органа на наличие нематодпод стереоскопическим микроскопом. Деструкции тканей не наблюдалось даже после пребывания в растворе карбамида в течение 4-5 часов (крупный объект,который приобрел значительную ригидность при длительном хранении в формалине). Пример 4. Сухие слоевища лишайников пармелии блуждающей и пармелии козлиной были помещены в 40-ный раствор карбамида на 12 часов, затем на 1 сутки для подготовки материала к лабораторному занятию. Уменьшение ригидности слоевищ наблюдалось уже через 1-2 часа после помещения в карбамид, и через гифы гриба стали частично видны клетки водоросли. Через 12 и 24 часа все слоевище стало прозрачным (даже плотный слой плектенхимы из гиф гриба), его кусочки легко укладывались на предметное стекло под покровное,где просматривались в капле того же раствора карбамида. Дальнейшие наблюдения показали, что через 1, 2 недели, через месяц деструкции лишайника не наступило. Пример 5. Сухие иглы сосны были помещены в 40-ный раствор карбамида на 12 часов, затем на 1 сутки для подготовки материала к лабораторному занятию. Прозрачность тканей хвои, наряду с уменьшением ригидности материала, отмечена уже через 5-6 часов. Через 12 и 24 ч консистенция и прозрачность этих грубых ботанических объектов была наиболее оптимальной для изготовления временных препаратов(в капле раствора карбамида). При длительном хранении (в том числе более 1-2 месяцев) деструкции объекта не наступило. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ подготовки зоологических и ботанических объектов к морфологическому исследованию,включающий извлечение из консерванта,расправление и просветление,отличающийся тем, что для расправления и просветления используют 30-40-ный водный раствор карбамида, в который объект помещают на период от 5-10 минут для мелких зоологических объектов до 3-5 часов для сухих или грубых ботанических объектов - до полного естественного распрямления и визуального просветления объекта.