Состав криопротектора для замораживания меристем черной смородины в жидком азоте

(51) 01 4/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ для сохранения биоразнообразия растительных ресурсов, сортов, гибридов и дикорастущих форм чрной смородины (.). Задачей и техническим результатом предлагаемого изобретения являются разработка усовершенствованного состава криопротектора для замораживания меристем чрной смородины в жидком азоте, позволяющего получать стабильное восстановление жизнеспособности криосохраннных меристем чрной смородины. Это достигается тем, что состав криопротектора для замораживания меристем чрной смородины в жидком азоте содержит глицерин и глюкозу,растворнные в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8, при следующем соотношении, г глицерин 49-50 глюкоза 49-50 жидкая среда Мурасиге и Скуга доведнная до 100 мл.(72) Ковальчук Ирина Юрьевна Турдиев Тимур Туйгунович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт плодоводства и виноградарства(54) СОСТАВ КРИОПРОТЕКТОРА ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ МЕРИСТЕМ ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ В ЖИДКОМ АЗОТЕ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к криосохране-нию вегетативно размножаемых растений и может использоваться Изобретение относится к биотехнологии, в частности к криосохранению вегетативно размножаемых растений и может использоваться для сохранения биоразнообразия растительных ресурсов, сортов, гибридов и дикорастущих форм чрной смородины (.). Известен состав криопротектора для замораживания меристем из растений земляники,состоящий из 6-ной глюкозы, 5-7-ного диметилсульфаксида, растворнные в жидкой питательной среде. (Описание изобретения к патенту Российской Федерации 2 220 563, по МПК А 01 Н 4/00, публ. 10.01.2004). Недостатком этого криопротектора является невысокое восстановление жизнеспособности криосохраннных меристем, а также сложность проведения замораживания. Кроме того,предлагаемый криопротектор рекомендуется для замораживания земляники, а для чрной смородины он будет малоэффективен. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является состав криопротектора,применяемый для предобработки меристем смородины при криосохранении техникой витрификации в жидком азоте. Состав криопротектора 2 (2) содержит 30-ный глицерин, 15-ный этиленгликоль и 15-ный диметилсульфаксид,растворнные в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8. (См..- ,,-. .,1997,34, 240-250). К недостаткам предлагаемого состава относится то,что восстановление жизнеспособности криосохраннных меристем невысокое,два компонента достаточно токсичны, а именно диметилсулфаксид и этиленгликоль, что может повредить целостность мембраны, затормозить фотосинтез, вызвать тяжлый плазмолиз и предрасположить клетки к повреждениям диаплазмолиза. Кроме того, эти вещества токсичны для человека. Задачей и техническим результатом предлагаемого изобретения являются разработка усовершенствованного состава криопротектора для замораживания меристем чрной смородины в жидком азоте, позволяющего получать стабильное восстановление жизнеспособности криосохраннных меристем чрной смородины. Это достигается тем, что состав криопротектора для замораживания меристем чрной смородины в жидком азоте содержит глицерин и глюкозу,растворнные в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8, при следующем соотношении, г глицерин 49-50 глюкоза 49-50 жидкая среда Мурасиге Скуга доведнная до 100 мл. Способ приготовления состава криопротектора заключается в следующем Взвешивают 50 г глицерина затем отдельно взвешивают 50 г глюкозы. В стакан с глицерином добавляют глюкозу не большими порциями,параллельно перемешивают пока раствор не станет однородным. В стерильных условиях ламинар-бокса наливают 15-20 мл стерильной жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8 и кладут маленький магнитик. Ставят стакан на магнитную мешалку без нагревания до полного растворения глицерина и глюкозы. В цилиндре доводят объем до 100 мл жидкой средой Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой. Закрывают цилиндр парафильмом и перемешивают. Стерилизуют криопротектор в автоклаве (20-25 мин. при 0,8-1,0 атм.), затем ставят в холодильник на 30 мин перед обработкой. Использование состава криопротектора при замораживании меристем чрной смородины следующее Асептические побеги культивируют в светокультуральном помещении при 16-часовом фотопериоде, интенсивности освещения 25-2-1 и контролируемой температуре 25 С. Растения,выращенные на питательной среде Мурасиге и Скуга, рекультивируют на свежую среду каждые 3 недели. В конце 3 недельного цикла растения помещают на акклиматизацию холодом, которую проводят в течение 3 недель в климатической камере (- Е,, ,) при чередующемся режиме 8 час 22 С(интенсивность освещения 10-2 -1), затем 16 час -1 С (без освещения). Или в течение 1-3 месяцев при постоянной температуре 4 С 8-ми часовом фотопериоде (интенсивность освещения 10-2 -1). Апикальные верхушки побегов с меристематической частью с 3-4 листовыми примордиями (от 0,8 до 1,0 мм) вычленяют из акклиматизированных побегов и прекультивируют в условиях холодовой акклиматизации на среде Мурасиге и Скуга (МС) с 0,3 М сахарозой, в течение 2 суток при чередующемся режиме 8 час 22 С(интенсивность освещения 10-2 -1), затем 16 час -1 С (без освещения). Меристемы помещают в раствор 2 М глицерина в 0,4 М сахарозе на 20 мин при 25 С, а затем помещают в криопробирки на кюветах со льдом с 1 мл предлагаемого криопротектора (50 г глицерина и 50 г глюкозы,растворнные в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8) на 80 мин. После этого криопробирки с меристемами чрной смородины помещают в жидкий азот. Размораживание образцов проводят в водяной бане при температуре 45 С в течение 1 мин, затем 1 мин в воде при 22 С. Верхушки побегов промывают жидкой средой Мурасиге и Скуга с 1,2 М сахарозой дважды, высушивают на фильтровальной бумаге и помещают на питательную среду для регенерации. Таблица 1 Восстановление жизнеспособности криосохраннных меристем черной смородины сорта Оджебин в зависимости от состава известного и предлагаемого криопротектора Наименование показателя Состав криопротектора для замораживания меристем черной смородины в жидком азоте Восстановление Известный Предлагаемый жизнеспособности 80,0 (48 шт из 60) 100,0 (60 шт из 60) криосохраненных мерисистем,получить стабильное восстановление Пример 1. криосохраннных меристем Состав криопротектора для замораживания жизнеспособности меристем чрной смородины в жидком азоте чрной смородины,высокую выживаемость содержит глицерин и глюкозу, растворнные в криосохраннных меристем,повысить срок 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга с 0,4 М хранения состава криопротектора до 2 месяцев,сахарозой при рН 5,8, при следующем соотношении, кроме того,для приготовления состава г использованы нетоксичные и дешвые компоненты,глицерин 49-50 что делает его более экономичным. глюкоза 49-50 жидкая среда Мурасиге и Скуга доведнная до ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 100 мл Готовили состав криопротектора по выше Состав криопротектора для замораживания указанному описанию, изменяя дозы глицерина и меристем чрной смородины в жидком азоте,глюкозы, соответственно 48 г и 51 г для обоих содержащий глицерин и другие компоненты,компонентов. При использовании меньшего растворнные в 100 мл жидкой среды Мурасиге и количества резко снижается процент Скуга с 0,4 М сахарозой при рН 5,8, отличающийся восстановления жизнеспособности криосохранения тем, что он в качестве других компонентов меристем, а при большем количестве происходит содержит глюкозу при следующем соотношении, г процесс кристаллизации состава. глицерин 49-50 Использование изобретения Состав глюкоза 49-50 криопротектора для замораживания меристем жидкая среда Мурасиге и чрной смородины в жидком азоте позволит Скуга доведнная до 100 мл.