Штамм “нисхи-ко” гриба trichophyton verrucosum, используемый для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота

(51)7 61 39/00, 12 1/14,12 1645 НАЦИОНАЛЬНОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Демченко Анатолий Григорьевич Ахмеров Равиль Абдуллаевич Сейткасымов Бейбит Каражигитович Муканов Касым Касымович(73) Научно-исследовательский сельскохозяйственный институт Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан(54) ШТАММ НИСХИ-КО ГРИБА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУХОЙ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к ветеринарной микологии и представляет собой аттенуированный штамм гриба, используемый для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота. Штамм НИСХИ-КО грибаНИСХИ НЦБ П/9-97/Д используют для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота. Штамм НИСХИ-КО дает максимальный прирост грибной массы с содержанием 900-1100 млн. спор/см 3 в течение 7-9 суток, что обеспечивает сокращение времени и снижение затрат на производство вакцины в 2-3 раза по сравнению с известным вакцинным штаммом 130. 9702 Изобретение относится к ветеринарной микологии и представляет собой аттенуированный штамм гриба, используемый для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота. Известен штамм 130- гриба, используемый для приготовления живой лиофилизированной вакцины (ЛТФ-130) против трихофитии крупного рогатого скота (Трихофития. Ветеринарные препараты // Под ред. Д.Ф. Осидзе. М. Колос, 1981, с. 301-306). На агаровых средах гриб растет медленно, в течение 25-30 суток, развивается лучше при 37 С. Колонии кожистые, бугристые, обычно голые, без воздушного мицелия периферия колоний плоская,довольно узкая. Мицелий редко септированный, диаметром 34 мкм, с единичными хламидоспорами диаметром 69 мкм. Микроконидии удлиненные, каплевидные или округлые, длиной 2-4 мкм и 1-2 мкм в диаметре. Макроконидии встречаются очень редко в виде коротких 3-5 клеточных веретен. Недостатком штамма 130 является его медленный рост. Задачей изобретения является получение штамма гриба, используемого для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота, обладающего быстрым ростом. Штамм НИСХИ-КО грибаНИСХИ НЦБ П/9-97 Д используют для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота. Штамм реизолирован и переклонирован из колоний эпизоотического вирулентного гриба Т, выделенного в 1993 году от больных телят в Кызыл-Ординской области Республики Казахстан. В результате длительного пассирования при различных температурных режимах получен апатогенный клон, не утративший иммуногенных свойств. Аттенуированный клоновый штамм НИСХИ-КО получен 20.12.1995 года и депонирован 18.12.1997 года в музее (банке) микроорганизмов Научно-исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан под регистрационным номером П/9-97/Д. Штамм НИСХИ-КО характеризуется следующими свойствами. Культивирование Штамм НИСХИ-КО выращивается в жидких питательных средах картофельно-углеводной (КУС) или томатно-углеводной (ТУС) с рН 7,2-7,4 при температуре 28-29 С, на качалках с амплитудой 120 колебаний в минуту и с аэрацией (подачей в культуральные колбы через барботажные трубки не менее 2 воздуха в минуту к объему среды). Максимум накопления грибной массы (80-90 к объему культуральной жидкости) штамма НИСХИ-КО наблюдается через 7-9 суток культивирования с образова 2 нием 900-1100 млн. спор/см 3. Немаловажным показателем при выращивании биомассы гриба штамма НИСХИ-КО является посевная концентрация спор. Суспензия инокулюма должна содержать не менее 1 млн. спор/см 3. В колбы с питательной средой вносится 6 инокулюма к объему среды. При культивировании штамма исключается освещение. На агаровых средах штамм растет в виде белых,ровных, стелющихся, порошистых колоний, хорошо видных невооруженным глазом на 4-5 сутки культивирования. Морфология В поле зрения микроскопа морфологические элементы штамма НИСХИ-КО представлены в виде бесцветного, ровного, септированного, ветвящегося мицелия от 3 до 5 мкм в диаметре, содержащего на гифах грушевидные или округлые микроконидии 1-2 мкм в диаметре и длиной 2-4 мкм. Макроконидии отсутствуют. Иногда встречаются концевые хламидоспоры диаметром до 6 мкм, но только при культивировании штамма на агаровых средах. Сравнительное изучение свойств штамма НИСХИ-КО грибас вакцинным штаммом 130 гриба,используемого при приготовлении вакцины ЛТФ 130 и выбранного нами в качестве прототипа, показало, что данные штаммы существенно отличаются по морфолого-культуральным свойствам. Штамм 130 культивируется на сусло-агаре при температуре 35-37 С в течение 25-30 суток до максимального накопления вакцинного сырья с содержанием 300400 млн. спор/см 3, в то время как штамм НИСХИКО дает максимальный прирост грибной массы в течение 7-9 суток с содержанием 900-1100 млн. спор/см 3, что обеспечивает сокращение времени и снижение затрат на производство вакцинных препаратов в 2-3 раза. Отличаются штаммы по росту колоний на агаровых средах. Штамм 130 растет медленно, образуя колонии кожистые, зернистые или бугристые, голые,без воздушного мицелия. По размерам морфологические элементы не имеют различий. Кроме того, штамм НИСХИ-КО обладает гемагглютинирующей активностью, а полученные к нему антисыворотки крови телят и кроликов - нейтрализующей активностью, что позволяет проводить серологические исследования в реакции задержки роста колоний (РЗРК) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Данные исследования при дерматомикозах не проводились. Ранее в Республике Казахстан не выделен иммуногенный штамм, который можно было бы использовать в разработке средств специфической профилактики трихофитии крупного рогатого скота. Известен ряд аттенуированных штаммов грибов рода , которые применялись для изготовления вакцин в странах ближнего зарубежья(Саркисов А, Никифоров Л.И.). Однако после распада СССР приобретать вакцинные препараты против трихофитии животных стало несколько затруднительно (таможенные пошлины, стоимость и прочее). Выделенный штамм НИСХИ-КО обладает иммуногенными свойствами при трихофитии крупного рогатого скота, безопасен для людей и животных,безвреден для лабораторных и сельскохозяйственных животных. При внутримышечном введении индуцирует у животных образование специфических антител, что позволяет использовать его для профилактики трихофитии крупного рогатого скота с месячного возраста. Штамм используют следующим образом. Пример. Все операции проводятся в специально подготовленном стерильном боксе. Матриксный(маточный) материал штамма НИСХИ-КО, прошедший проверку на стерильность, отсутствие посторонних примесей и контаминантов, биологическую активность на телятах и безвредность для кроликов при внутримышечном введении, разводят стерильным физиологическим раствором, доводя концентрацию до 1 млн. спор/см 3. В культуральные колбы с питательной средой инокулируют 6 данной суспензии к объему среды. Инокулированные колбы закрывают резиновыми пробками, имеющими барботажную трубку и ватный фильтр. Колбы помещают на качалку с амплитудой 120 импульсов в минуту в затемненную термальную комнату с температурой 28-29 С. Барботажные трубки под ключают при помощи резиновых шлангов к компрессору. Воздух, подаваемый в колбы, стерилизуется, проходя через емкости, содержащие 5 раствор фенола и 30 раствор едкого натра. На вторые сутки культивирования в колбах образуется множество круглых колоний (склероций) гриба,которые увеличиваются и к 7-9 суткам культивирования заполняют 80-90 объема питательной среды. Полученную биомассу гомогенизируют (дробно по 2-3 минуты на холоде) в течение 18-24 минут до полного измельчения мицелия. При микроскопии гомогенат должен содержать свободно лежащие споры и фрагменты мицелия длиной не более 20 мкм. При этом подсчитывают при помощи камеры Горяева количество спор в 1 см 3. Гомогенант разбавляют стерильным физраствором, доводя концентрацию до не менее 10 млн. спор в 1 дозе вакцинного препарата. К полученной таким образом суспензии добавляют стабилизирующую среду, содержащую 4 сахарозы и 4 пептона, тщательно перемешивают и разливают в ампулы по 1-2 см 3 или флаконы по 2-4 см 3 (в зависимости от количества доз вакцины). Ампулы или флаконы с биоматериалом замораживают до минус 60-70 С и лиофильно высушивают. Ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. Подготовленную серию вакцины проверяют на растворимость, стерильность,безвредность, апирогенность и иммуногенность. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм НИСХИ-КО грибаНИСХИ НЦБ П/9-97/Д, используемый для приготовления сухой живой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота.