Штамм бактерий micrococcus roseus 49-7 для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

(51) 12 1/20 (2006.01) 09 1/10 (2006.01) 12 1/265 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ нового штамма нефтеокисляющих бактерий,который может быть использован для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Задачей изобретения является получение штамма бактерий с более высокой нефтеокисляющей активностью. Техническим результатом является получение нового штамма бактерий 49-7,включение которого в состав препаратов для очистки почв от нефти и нефтепродуктов позволит повысить их эффективность за счет повышенного содержания в них жизнеспособных клеток на 1 порядок и более высокой нефтеокисляющей способности (на 23-25).(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Шорабаев Ерик Жарылкасынович(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 49-7 ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается получения нового штамма нефтеокисляющих бактерий, который может быть использован для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. В настоящее время для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений используются биопрепараты на основе активно разлагающих нефть микроорганизмов бактерий родов, , , дрожжей , нитевидных актиномицетов , грибовии др. (Демьяненко А.Ф., Мизгирев Н.С. Микробиологическая очистка грунтов от нефтепродуктов в закрытых реакторах изотермического типа // Вестник ВНИИЖТ, 2005,6). Создание высокоэффективных биопрепаратов для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов возможно лишь на основе активных углеводородокисляющих микроорганизмов и ассоциаций, адаптированных к условиям загрязнения, и разработки оригинальной технологии их производства с учетом физиологических особенностей штаммов. Известен штамм нефтеокисляющих бактерий 49,выделенный из нефтезагрязненной почвы Атырауской области(Инновационный патент РК 24260. Бюл.7. от 15.07.2011). Недостатком штамма является недостаточно высокая нефтеокисляющая активность. Задачей изобретения является получение штамма бактерий с более высокой нефтеокисляющей активностью. Поставленная задача достигается получением нового штамма М.49-7 с повышенной нефтеокисляющей активностью и устойчивостью к сублимационному высушиванию. Штамм выделен из популяции М.49 после 3-кратного сублимационного высушивания. Штамм М.49-7 представляет собой кокки,одиночные, в парах и в скоплениях, размером 1,252,0 мкм. Грамположительные, некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 1-2 мм. Край колоний ровный, пигменты в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ происходит помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется кольцевидная пленка. В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, маннозу. Крахмал не гидролизует,желатин не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий М.49-7 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-31. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. Культуры микроорганизмов М.49 и 49-7 выращивают в модифицированной питательной среде ВД (Ворошилова-Дианова) следующего состава,43 - 1,0 К 2 НР 4 - 1,0 КН 2 Р 4 - 1,0 4 - 0,2 СаС 2 - 0,02 3 - 2 капли концентрированного раствора,- 10,0 глюкоза - 1,0 питательный бульон - 1,0 сырая нефть 0,1 вода - остальное,среды - 6,8-7,0. Жидкую питательную среду засевают упомянутыми культурами микроорганизмов(каждую отдельно) в количестве 5 смывом с косяков МПА (п.108 КОЕ/мл) и культивируют на качалке в течение 1 суток при температуре 28 С. Полученный посевной материал индивидуальных штаммов засевают в ферментационную питательную среду того же состава и выращивают в аэробных условиях в течение 2 суток. После окончания ферментации в культурах определяют титр бактерий путем их высева из соответствующих разведений на поверхность плотной питательной среды МПА. Подсчет колоний производят на 3-4 сутки после термостатирования при 28-30 С. Нефтеокисляющую активность устанавливают гравиметрическим методом при росте культур в среде ВД с 2 нефти на качалке в течение 10 суток. Полученные результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Титр и нефтеокисляющая активность различных штаммов бактерий при росте в модифицированной среде ВД Штаммы бактерий Установлено, что предлагаемый штамм М.49-7 при выращивании в модифицированной питательной среде ВД превосходит противопоставляемый штамм М.49 по накоплению бактериальных клеток на 1 порядок, по нефтеокисляющей активности - на 25,9. Пример 2 Культуры микроорганизмов М.49 и 49-7 выращивают в питательной среде с соевой мукой 2 следующего состава,КН 2 РО 4 - 2,0 2 НР 4 - 3,0 4 - 0,5 (4)24 - 2,0 СаС 2 - 0,01, 3, 0,05 соевая мука - 5,0, сахароза -10,0, вода - до 1 л, 6,8-7,2. Жидкую питательную среду засевают упомянутыми культурами микроорганизмов(каждую отдельно) в количестве 5 смывом с косяков МПА (п.108 КОЕ/мл) и культивируют на качалке в течение 1 суток при температуре 28 С. Полученный посевной материал индивидуальных штаммов засевают в ферментационную питательную среду того же состава и выращивают в аэробных условиях в течение 2 суток. После окончания ферментации в культурах определяют титр бактерий путем их высева из соответствующих разведений на поверхность плотной питательной среды МПА. Подсчет колоний производят на 3-4 сутки после термостатирования при 28-30 С. Нефтеокисляющую активность устанавливают гравиметрическим методом при росте культур в среде ВД с 2 нефти на качалке в течение 10 суток. Полученные результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Титр и нефтеокисляющая активность различных штаммов бактерий при росте в питательной среде с соевой мукой Штаммы бактерий Установлено, что предлагаемый штамм М.49-7 при выращивании на питательной среде с соевой мукой превосходит противопоставляемый штамм .34 по накоплению бактериальных клеток на 1 порядок, по нефтеокисляющей активности - на 23,7. Пример 3 Получение сухого препарата. Выращивание бактерий проводят аналогично примеру 1. Для осаждения биомассы в жидкую культуру добавляют 3 бентонита. Через 2-3,5 ч биомассу, адсорбированную на бентоните, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. В бактериальную пасту добавляют 0,5 тиомочевины,разливают в специальные металлические лотки слоем не более 1,0 см. Лотки помещают в морозильную камеру и замораживают при температуре - 40-50 С в течение 6 часов. Высушивают в сублимационной сушилке 35. Температура досушивания продукта 25 С,разряжение 45 Па. Показатели качества сухих препаратов из различных штаммов бактерий представлены в таблице 3. Таблица 3 Содержание жизнеспособных клеток бактерий в сублимационно высушенных препаратах и их нефтеокисляющая активность Штаммы 4949-7 Титры культур, (КОЕ/г) до высушивания после высушивания 3,51011 3,2 х 1012 12 4,7 х 10 9,4 х 1013 Наибольшее количество жизнеспособных клеток выявлено в препарате из культуры .49-7(9,4 х 1013 по сравнению с 3,2 х 1013 КОЕ/г). Препарат из штамма М.49-7 утилизировал нефть на 86, из штамма М.49 - на - 63. Таким образом, штамм бактерий М.49-7 превосходит штамм М.49 по накоплению бактериальных клеток на 1 порядок, по утилизации нефти - на 23-25. Нефтеокисляющая активность сухих препаратов,63,0 86,0 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 49-7,депонирован в коллекции ИМиВ МОН РК, под номером ИМиВ В-31, предназначенный для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов.