Способ получения антигена для диагностики хламидиоза животных

(51) 61 39/118 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ забуференным физиологическим раствором (ЗБФР) с рН 7,2, гомогенизируют в аппарате Уорринга при 5000 об/мин. в течение 3-5 мин. проводят ультразвуковую обработку хламидиесодержащей суспензии при частоте 22 КГц и мощности 70-90 вт/см 2 в течение 5-7 минут, с целью очистки возбудителя проводят двукратное центрифугирование хламидиесодержащей биомассы в градиенте сахарозы, инактивацию осуществляют формальдегидом в конечной концентрации 0,4 в течение 72 ч. при температуре реакционной среды 37 С. Далее осуществляют лиофильное высушивание антигена при использовании в качестве среды высушивания добавлением в него 4 пептона и 3 сахарозы. Предлагаемая схема очистки и концентрирования обеспечивает 70 выход возбудителя хламидиозов с.-х. животных при степени очистки 98,5, что позволяет получать достаточно активный и специфичный антиген (титр в РСК не менее 1128, тогда как контрольный 132164) для диагностики хламидиоза животных.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Абеуов Хайрулла Блялович Хусаинов Дамир Микдатович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии,в частности к способам диагностики хламдиоза и может быть использовано при приготовлении антигена для диагностики хламидиоза животных. Технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения антигена штамм хламидин культивируют в желточном мешке 6-7 суточных развивающихся куриных эбрионов до биологической активности не менее 6,0 ЭЛД 50/0,2 см 3,биоматериал суспендируют Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии,в частности к способам диагностики хламдиоза и может быть использовано при приготовлении антигена для диагностики хламидиоза животных. Известен способ получения антигена для диагностики хламидиоза животных, включающий культивирование возбудителя в желточном мешке развивающихся куриных эмбрионов, осаждение 20-ной взвеси на 0,2 М фосфатно-буферном растворе (р 7,2) путем центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы, обработку 0,1 додецилсульфатом натрия и 1 этилмеркаптаном,диализом против 0.15 М хлористого калия в течение 48 часов А.с. СССР 1667870 1. кл. А 61 39/118. С 12 1/20. опубл. 07.08.1991, бюл.29. Недостатком указанного способа получения антигена является его сложность и то, что очищенный таким образом антиген недостаточно освобожден от клеточного детрита, балластного белка и липида, вследствие чего он обладает низкой активностью и специфичностью, а также короткий срок хранения антигена. Задача изобретения - снижение себестоимости,повышение чувствительности и периода храпения антигена. Задача решается тем, что дополнительно проводят ультразвуковую обработку хламидиесодержащей суспензии при частоте 22 КГц и мощности 70-90 вт/см 2 в течение 5-7 минут, а инактивацию осуществляют 0,4 формальдегидом с последующим лиофильным высушиванием,Полученный при этом технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в снижении себестоимости, повышении активности и специфичности антигена,удлинении сроков хранения. Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения антигена штамм хламидий культивируют в желточном мешке 6-7-суточных развивающихся куриных эмбрионов до биологической активности не менее 6.0 ЭЛД 50/0,2 см 3, биоматериал суспендируют забуференным физиологическим раствором (ЗБФР) с 7,2, гомогенизируют в аппарате Уорринга при 5000 об/мин. в течение 35 мин., проводят ультразвуковую обра б от к у хламидиесодержащей суспензии при частоте 22 КГц и мощности 70-90 вт/см 2 в течение 5-7 минут, с целью очистки возбудителя проводят двукратное центрифугирование хламидиесодержащей биомассы в градиенте сахарозы, инактивацию осуществляют формальдегидом в конечной концентрации 0,4 в течение 72 ч при температуре реакционной среды 37 С. Далее осуществляют лиофильное высушивание антигена при использовании в качестве среды высушивания добавлением в него 4 пептона и 3 сахарозы. Способ осуществляется следующим образом Пример 1. Для культивирования хламидий отбирают хорошо развитее 6-7-суточные развивающиеся куриные эмбрионы. 2 Поверхность куриного эмбриона над воздушной камерой обрабатывают и обжигают спиртовым тампоном, пробойником прокалывают отверстия в скорлупе в центре над воздушной камерой и через это отверстие вводят иглу шприца под утлом 5-7 влево т эмбриона на глубину 3-4 см. В полость желточного мешка развивающихся куриных эмбрионов инокулируют 0,2-0,3 см 3 хламидиесодержащей суспензии. После введения материала отверстие заливают расплавленным парафином и эмбрионы инкубируют при 3,71 С в термостате или инкубаторе. Для поддержания оптимальной влажности воздуха на основании камеры термостата ставят посуду с водой,Зараженные проверяют 2-3 раза в день овоскопированием. При учете результатов инфицирования развивающихся куриных эмбрионов гибель в течение первых 3 сут. считают неспецифической и их исключают из опыта, а эмбрионов, павших с 4 по 11 сут. после заражения считают специфическими и подвергают дальнейшему исследованию. Погибшие, в эти дни,эмбрионы хранят при 4-6 С. но не более двух сут.,вскрывают с соблюдением правил асептики,извлекают желточные мешки и помещают их в пенициллиновые флаконы. Одновременно, из оболочки желточных мешков, после нескольких раз промывания в физиологическом растворе делают мазок-отпечаток для установления стерильности и накопления возбудителя. Желточные мешки до использования хранят в холодильнике при температуре минус 40 С. Пример 2. С целью достижения максимального выхода хламидий материал оболочек желточного мешка эмбрионов подвергают гомогенизации в течение 3-5 мин., при 5000 об/мин., далее проводят ультразвуковую обработку суспензию хламидий при частоте 22 КГц и мощности 70-90 вт/см 2 в течение 5-7 минут и осветляют центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 30 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость в соотношении 120 разводят забуференным физиологическим раствором, 7,2. Полученную суспензию наслаивают поверх замороженного слоя 36 г/100 см 3 сахарозы, приготовленной на том же буфере, разливают в центрифужные пробирки ротора 27 центрифуги 2-65 , и после оттаивания центрифугируют при 15000 об/мин, в течение 90 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 5 объемах указанного буфера и центрифугируют в преформированном градиенте сахарозы с концентрацией 20-60 г/100 см 3 при 18000 об/мин. в течение 40 мин. Отбирают опалесцирующую зону в области 48-50 г/100 см 3 и суспендируют в буфере до первоначального объема. Полученную суспензию повторно центрифугируют через слой сахарозы с концентрацией 36 г/100 см 3 притом же режиме. Полученный осадок ресуспендируют до исходного объема, добавляют в него 4 пептона и 3 сахарозы и подвергают лиофильному высушиванию. хламидийного антигена представлены в таблице 1. Таблица 1 Результаты очистки хламидийного антигена Степень очистки Количество белка,мг/мл Исходная осветленная суспензия частиц Осадок после первичного центрифугирования 0,610,01 через 36 сахарозу Материал из полосы после центрифугирования в 0,490,02 градиенте сахарозы Осадок после повторного центрифугирования 0,400,01 через 36 сахарозу Как видно из таблицы 1, предлагаемая схема 20-ной взвеси на 0,2 М фосфатно-буферном очистки и концентрирования обеспечивает 70 растворе (р 7,2) путем центрифугирования в выход возбудителя хламидиозов с.-х. животных при ступенчатом градиенте сахарозы, обработку 0,1 до степени очистки 98,5, что позволяет получать децилсульфатом натрия и 1 этилмеркаптаном,достаточно активный и специфичный антиген (титр диализом против 0,15 М хлористого калия в течение в К не менее 1128, тогда как контрольный 132- 48 часов, отличающийся тем, что дополнительно 164) для диагностики хламидиоза животных. проводят ультразвуковую обработку хламидиесодержащей суспензии при частоте 22 КГц и мощности 70-90 вт/см 2 в течение 5-7 минут, а ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ инактивацию осуществляют 0,4 формальдегидом с Способ получения антигена для диагностики последующим лиофильным высушиванием при хламидиоза животных,включающий использовании в качестве среды высушивания культивирование возбудителя в желточном мешке добавлением в него 4 пептона и 3 сахарозы. развивающихся куриных эмбрионов, осаждение