Ibor-ins модификация гена, полученный из ipomoea batatas, рекомбинантный вектор,клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором, способ получения трансформированного растения, трансформированное растение, имеющее повышенное содержание каротиноида, способ получения трансформированного двудольного растения, трансформированное двудольное растение, имеющее повышенную устойчивость к солевому стpессу, генная вставка для повышения содержания каротиноида в растении и устойчивости к солевому стрессу растения

(51) 01 5/00 (2006.01) 01 5/10 (2006.01) 12 15/29 (2006.01) 12 15/82 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ ТРАНСФОРМИРОВАННОЕ ДВУДОЛЬНОЕ РАСТЕНИЕ, ИМЕЮЩЕЕ ПОВЫШЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К СОЛЕВОМУ СТЕССУ,ГЕННАЯ ВСТАВКА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КАРОТИНОИДА В РАСТЕНИИ И УСТОЙЧИВОСТИ К СОЛЕВОМУ СТРЕССУ РАСТЕНИЯ(57) Настоящее изобретение относится к способу получения - мутации гена, представляющей собойген, полученный из,в который искусственно вставлена определенная последовательность рекомбинантного вектора,включающего генную мутацию клетки-хозяина,мутированной рекомбинантным вектором и трансформированного растения,имеющего увеличенное содержание каротиноида и повышенную устойчивость к солевому стрессу за счет мутации, вызванной рекомбинантным вектором в клетке растения. Настоящее изобретение относится также к способу получения трансформированного растения,имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу,путем использования трансформированного растения или его семян,полученных вышеуказанным способом, имеющих повышенные содержание каротиноида и устойчивость к солевому стрессу, обусловленные использованием гена, полученного из. Изобретение также относится к трансформированному растению, полученному вышеуказанным способом и имеющему повышенную устойчивость к солевому стрессу, а также к семенам, полученным из него.(73) Кореа Рисрч Инститьют оф Байосайенс энд Байотекнолоджи(74) Русакова Нина Васильевна Жукова Галина Алексеевна Ляджин Владимир Алексеевич Ляджин Алексей Владимирович Иванова Антонина Сергеевна- МОДИФИКАЦИЯ ГЕНА,ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ,РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР,КЛЕТКАХОЗЯИН,ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ ВЕКТОРОМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННОГО РАСТЕНИЯ,ТРАНСФОРМИРОВАННОЕ РАСТЕНИЕ, ИМЕЮЩЕЕ ПОВЫШЕННОЕ СОДЕРЖАНИЕ КАРОТИНОИДА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННОГО ДВУДОЛЬНОГО РАСТЕНИЯ, 29184 Настоящее изобретение относится к модификации гена, полученного из батата (), и использованию этой модификации гена. Точнее сказать, оно относится к модификациигена, имеющей специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный изк рекомбинантному вектору, включающему эту модификацию гена к клетке-хозяину,трансформированной с помощью этого рекомбинантного вектора к способу получения трансформированного растения,имеющего повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу,обусловленные трансформацией растительной клетки рекомбинантным вектором к трансформированному растению,имеющему повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу,которое получено с помощью этого способа, и к его семенам к способу получения трансформированного растения,имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу, с использованиемгена, полученного изи к трансформированному растению, имеющему повышенную устойчивость к солевому стрессу, полученному с помощью этого способа, и к его семенам. Предпосылки изобретения Батат (.) представляет собой корнеплод, который может культивироваться на относительно бедной почве с урожайностью около 30 тонн с гектара, он употребляется в качестве пищи, а также пищевого продукта для скота. Окрашенный батат, имеющий фиолетовый цвет, желтый цвет или подобный им, содержит различные анти-оксиданты. В частности, желтый батат, батат желтого цвета, содержит бета-каротин в количестве 14,7-20 мг/100 г, а фиолетовый батат содержит антоциан в количестве 2,28 г/100 г, чем обусловлена их превосходная антиоксидантная активность, обеспечивающая удаление активного кислорода, который содействует старению клеток и является причиной различных заболеваний у взрослых. С 1990-х годов была опробована трансформация путем сокультивирования си разработана система регенерации и трансформации растений путем индукции культуральных клеток с эмбриогенной компетенцией и эмбриогенеза соматических клеток из апикальной и латеральной меристем (.19, 227-239, 2007). Однако о батате, способном продуцировать высокий уровень низкомолекулярных антиоксидантов, таких как каротиноид, антоциан и полифенол, публикаций еще не имеется. Таким образом, получение новых сельскохозяйственных культур,имеющих устойчивость к разнообразным стрессам и способных продуцировать высокий уровень низкомолекулярных антиоксидантов, может дать свой вклад в решение проблем, относящихся к продовольствию, энергии и окружающей среде, с которыми столкнется человечество в 21 столетии. 2 Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщает, что более ста миллионов детей в мире страдают от дефицита витамина А, и каждый год более половины миллиона детей теряют зрение из-за этого дефицита. Бета-каротин как предшественник витамина А обладает физиологической активностью в качестве пищевой и биологически активной добавки и,таким образом,знания по искусственному изменению метаболизма,касающиеся накопления каротиноида в продуктах питания, являются важным предметом исследования для улучшения их пищевой ценности. Одним из примеров таких попыток могут служить исследования по повышению пищевой ценности сельскохозяйственных культур на основе применения методов молекулярно-биологической и метаболической инженерии к генам, относящимся к метаболическим путям каротиноида. Известно, что каротиноид играет не только физиологическую роль в качестве антиоксиданта высокой активности, но также играет и важную роль в механизме защиты самих растений от оксидативного стресса. Недавно было найдено, что на биосинтез каротиноида оказывает влияние абсцизовая кислота(АВА),являющаяся растительным гормоном, в результате сразу возникла необходимость в изучении антиоксидантов и стрессов, обусловленных окружающей средой. Многие регионы во всем мире из-за высокой засоленности превращены в низкоплодородные земли со сниженной на 70 или более продуктивностью сельскохозяйственных культур или превращаются в пустующие земли,непригодные для земледелия. Таким образом,разработка солеустойчивых сортов растений становится актуальной. Корейский патент,регистрационный номер . 10-0813284, раскрывает способ повышения содержания каротиноида путем трансформации растения геном фермента для биосинтеза фитоена, выделенным из мандарина, а корейская выложенная заявка . 2010-0100097 раскрывает способ повышения устойчивости к солевому стрессу растений путем трансформации растения геном , выделенным из батата. Подробное описание изобретения Технические проблемы,которые нужно разрешить Настоящее изобретение задумано под влиянием описанных выше обстоятельств, и авторы настоящего изобретения завершили работу по настоящему изобретению подтверждением того, что растения,трансформированные модификацией гена, представляющей собой ген, выделенный из, в который вставлена определенная нуклеотидная последовательность,имеют повышенное содержание каротиноида и повышенную устойчивость к солевому стрессу. Технические средства для решения проблем Для решения проблем, описанных выше, в настоящем изобретении заявляется модификация гена, имеющая специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно. В настоящем изобретении заявляется также рекомбинантный вектор,включающий эту модификацию гена. В настоящем изобретении заявляется клеткахозяин,трансформированная рекомбинантным вектором. В настоящем изобретении заявляется также способ получения трансформированного растения,имеющего повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу,обусловленные трансформацией растительной клетки рекомбинантным вектором. В настоящем изобретении заявляется также полученное этим способом трансформированное растение, имеющее повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу, и его семена. В настоящем изобретении заявляется также способ получения трансформированного растения,имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу, основанный на использованиигена, полученного из. В настоящем изобретении заявляется также полученное этим способом трансформированное растение, обладающее повышенной устойчивостью к солевому стрессу, и его семена. В настоящем изобретении заявляется также генетическая вставка для повышения содержания каротиноида или устойчивости к солевому стрессу растения, включающая - модификацию гена,имеющую специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный из. В настоящем изобретение заявляется также генетическая вставка для повышения устойчивости растения к солевому стрессу, включающаяген, полученный из. Полезный эффект изобретения Согласно настоящему изобретению, показано,что растительная клетка, трансформированная геноми - модификацией гена,обладает повышенным содержанием каротиноида и повышенной устойчивостью к солевому стрессу, и этот эффект более значителен в -трансформированных клетках. По существу,ожидалось, что, используяген или модификацию гена по настоящему изобретению,можно сконструировать трансформированное растение, имеющее не только улучшенную функцию, но также и повышенную устойчивость к солевому стрессу. Краткое описание фигур Фиг.1 иллюстрирует нуклеотидную последовательность гена -, полученного искусственной мутацией исходного гена ,полученного из батата (сорт ), и соответствующую ей аминокислотную последовательность. Выделенная рамкой область указывает участок,в который вставлена специфическая нуклеотидная последовательность,ответственная за аминокислотную последовательность,которая отличается от существующейи составляет 924 нуклеотидные пары (н.п.) кДНК, кодирующие 207 аминокислот. Фиг.2 иллюстрирует сравнение и определение аминокислотной последовательностии аминокислотной последовательности-,полученной из батата. Выделенная рамкой область показывает участок, в котором имеются различия. Фиг.3 иллюстрирует растительный экспрессионный вектор для генаи гена-, полученного из батата. Фиг.4 иллюстрирует желтый фенотип клеток культуры батата, обусловленный повышенным содержанием каротиноида,в которых культуральные клетки были трансформированы геномили геном -, полученными из батата. Фиг.5 иллюстрирует результаты анализа по содержанию каротиноида бета- каротина в трансформированных культуральных клетках,полученные с помощью- анализа(жидкостная хроматография высокого давления). Фиг.6 иллюстрирует профиль экспрессии основных генов, вовлеченных в биосинтез каротиноида в культуральных клетках батата,которые были трансформированы геномили геном -, полученными из батата, в которых профиль экспрессии гена определяли с помощью - (полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) и электрофореза. Фиг.7 иллюстрирует фенотип культуральных клеток, окрашенных(3,3-диаминобензидин)(вверху), и воздействие окислительного стресса на культуральные клетки (внизу), где культуральные клетки батата были трансформированы геномили геном -, полученными из батата, с последующей обработкой 150 мМ или 200 мМ . Фиг.8 иллюстрирует фенотип семян (вверху) и содержание бета-каротина в листьях (внизу), который был трансформирован геномили геном -, полученными из батата, где содержание бета-каротина было измерено с помощью спектрофотометрадикий тип (колонка 0). Фиг.9 иллюстрирует профиль экспрессии гена в отношении биосинтеза каротиноида в, трансформированном геномили геном -, полученным из батата, и профиль экспрессии генаи гена, где профиль экспрессии гена был определен с помощью - и электрофореза. Фиг.10 иллюстрирует профиль экспрессии каротиноиддиоксигеназыкак одного из стресс-индуцибельных генов,трансформированного геномили геном-, полученными из батата, где профиль экспрессии гена был определен с помощью и электрофореза. Фиг.11 иллюстрирует скорость прорастания, трансформированного геном или геном -, на среде, обработанной 0, 50, 100 или 150 мМ . Фиг.12 иллюстрирует вес сырого, трансформированного геномили геном -, а также дикого типа в качестве контрольной группы после обработки различными концентрациями . Фиг.13 иллюстрирует сравнение фенотипа корня, трансформированного геномили геном -, а также дикого типа в качестве контрольной группы в условиях 100 мМ. Фиг.14 иллюстрирует результаты измерения значения относительной влажности в, трансформированном геномили геном -, а также дикого типа в качестве контрольной группы в условиях 150 мМ . Чтобы достичь цели изобретения, в настоящем изобретении заявляется - модификация гена,имеющая специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную в ген , полученный из. Согласно настоящему изобретению, модификация гена была получена путем вставки аминокислотной последовательности вида. Однако,поскольку данная последовательность является одним из вариантов,способствующих увеличению содержания каротиноида или повышению солеустойчивости, она не особенно ограничена ею. В настоящем изобретении заявляется также рекомбинантный вектор,включающий модификацию гена. Термин рекомбинантный обозначает клетку,которая реплицирует гетерогенные нуклеотиды или экспрессирует указанные нуклеотиды, или пептид,или гетерогенный пептид,или протеин,закодированный гетерогенными нуклеотидами. Рекомбинантная клетка может экспрессировать ген или фрагмент гена в виде смысловой или антисмысловой последовательности, которые не встречаются в естественном состоянии клетки. Кроме того, рекомбинантная клетка может экспрессировать ген, который встречается в естественном состоянии, после того как упомянутый ген модифицируется и вводится вновь в клетку искусственным образом. Согласно настоящему изобретению,последовательность - модификации гена может быть включена в рекомбинантный экспрессионный вектор. Термин рекомбинантный экспрессионный вектор означает бактериальную плазмиду, фаг, дрожжевую плазмиду, вирус растительной клетки, вирус клетки млекопитающих или другой вектор. Обычно может быть использована любая плазмида и вектор, если она/он может размножаться или устойчиво существовать в хозяине. Важной характеристикой экспрессионного вектора является то, что он включает начало репликации, промотор, репортерный ген и элемент контроля трансляции. Экспрессионный вектор включает последовательность ДНК для кодирования - 4 протеина и подходящие элементы контроля транскрипции/трансляции, которые могут быть сконструированы с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области. Данный способ включает метод рекомбинантной ДНК, метод синтеза ДНК и метод рекомбинантной технологии. Для индукции синтеза мРНК последовательность ДНК может быть эффективно скомпонована с соответствующим промотором,имеющимся в экспрессионном векторе. Кроме того,экспрессионный вектор может включать сайт для связывания с рибосомой в качестве сайта инициации трансляции, а также терминатор транскрипции. Предпочтительным примером рекомбинантного вектора согласно настоящему изобретению является-плазмидный вектор, который может передавать часть себя, т.е. так называемую Т-область, в растительную клетку, когда данный вектор присутствует в подходящей клетке-хозяине, такой как. Другой тип плазмидного вектора (см. ЕР 0 116718 В 1) используется в настоящее время для передачи гибридной ДНК-последовательности в протопласты,что может привести к образованию нового растения путем соответствующего встраивания ДНК растительной клетки или гибридной ДНК в геном растения. Особенно предпочтительной формой плазмидного вектора является так называемый бинарный вектор, раскрытый в ЕР 0 120 516 В 1 и патенте США 4.940.838. Другие векторы,которые могут быть использованы для введения ДНК по настоящему изобретению в растениехозяина, могут быть выбраны из двуспирального растительного вируса(например СаМ),односпирального вируса и вирусного вектора,который может происходить из вируса , и т.д., например, неполный растительный вирусный вектор. Использование указанного вектора может быть особенно полезным в случаях, когда растениехозяин плохо трансформируется. Экспрессионный вектор может включать по крайней мере один селективный маркер. Упомянутый селективный маркер представляет собой нуклеотидную последовательность, которая может быть выбрана путем использования обычных химических методов. Примеры включают все гены,которые пригодны для того, чтобы отличить трансформированные клетки от нетрансформированных. Конкретные их примеры включают ген устойчивости к антибиотикам, таким как глифосат и фосфинотрицин, и ген, устойчивости к антибиотикам, таким как канамицин, 418,блеомицин, гигромицин и хлорамфеникол, но не ограничиваются ими. Для рекомбинантного вектора согласно настоящему изобретению промотор может быть любым из 35, актина, убиквитина, , или гистоновым промотором, но не ограничивается ими. Термин промотор означает молекулу ДНК, с которой связывается РНКполимераза, чтобы инициировать ее транскрипцию,и она соответствует участку ДНК перед структурным геном. Термин растительный промотор означает промотор, который может инициировать транскрипцию в растительной клетке. Термин конститутивный промотор означает промотор, который активен при большинстве условий окружающей среды и на большинстве стадий развития или стадий дифференцировки клеток. Так как может быть выбран трансформант с различными механизмами на различных стадиях,конститутивный промотор может быть предпочтительным для настоящего изобретения. Поэтому возможность для выбора конститутивного промотора здесь не ограничивается. Для рекомбинантного вектора по настоящему изобретению может использоваться любой общеиспользуемый терминатор. Примеры включают терминатор нопалин синтазы , терминатор аамилазы 1 риса, терминатор гена фазеолина,терминатор гена октопинаи т.д., но не ограничиваются ими. В отношении необходимости терминатора в основном известно,что наличие такой области должно повышать надежность и эффективность транскрипции в растительных клетках. Поэтому использование терминатора крайне предпочтительно с точки зрения содержания настоящего изобретения. В настоящем изобретении заявляется также клетка-хозяин,трансформированная рекомбинантным вектором по настоящему изобретению. В качестве клетки- хозяина может быть использована любая известная специалистам в данной области прокариотическая клетка,обладающая свойством стабильного и непрерывного клонирования и экспрессии вектора по настоящему изобретению. Примеры таких клеток включают штаммы., включающие . 109,. 21, . 1, . 392, . , . 1776, . 3110,,и им подобные, кишечные бактерии и штаммы, включающие, , а также различные. и т.д. Кроме того, когда вектором по настоящему изобретению трансформируется эукариотическая клетка, в качестве клетки-хозяина могут быть использованы дрожжевая клетка ((клеток яичника китайского хомячка, растительная клетка и им подобные. Предпочтительно, чтобы клеткой - хозяином была растительная клетка. Когда клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, вектор по настоящему изобретению может быть доставлен в клеткухозяина с помощью СаС 2 - метода, метода(, ., . . ., 166557-580 (1983 или метода электропорации и т.п. Кроме того, когда клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, вектор может быть введен в клетку-хозяина с помощью метода микроинъекции,метода преципитации фосфатом кальция, метода электропорации,метода трансфекции с использованием липосом, метода с использованием обработки ДЭАЭ-декстраном или метода с использованием генного ружья и им подобных. Трансформация растения означает любой метод,с помощью которого ДНК доставляется в растение. Такой метод трансформации не требует времени для регенерации и/или использования культуры ткани. Трансформация растительных видов в настоящее время довольно распространена не только для двудольных растений, но также и для однодольных. В принципе, для введения гибридной ДНК по настоящему изобретению в соответствующие исходные клетки может быть использован любой способ. Способ может быть выбран из метода слияния протопластов,индуцированного кальцием/полиэтиленгликолем (, .,1982,296,72-74..,1987, 8, 363-373), метода электропорации для протопластов ( ., 1985/. 3, 1099-1102), метод введения с помощью микроинъекций для растительных компонент ( . . ., 1986, . 202, 179-185), метода бомбардирования частицами(которые покрыты ДНК или РНК) для различных растительных компонент ( Т.М.., 1987, 327, 70) или метода неполной вирусной инфекции для переноса гена с помощьюпутем заражения растения или трансформации полностью созревшей пыльцы или микроспор (ЕР 0 301 316) и т.д. Предпочтительным способом в настоящем изобретении является перенос ДНК с помощью. В частности, для настоящего изобретения предпочтительным является использование так называемой бинарно-векторной технологии, раскрытой в ЕР А 120 516 и в. 4,940,838. В настоящем изобретении заявляется также способ получения трансформированного растения,имеющего повышенное содержание каротиноида,включающий сверхэкспрессию модификации гена,достигаемую путем трансформации растительной клетки рекомбинантным вектором по настоящему изобретению. В настоящем изобретении заявляется также трансформированное растение,имеющее повышенное содержание каротиноида, которое получено с помощью описанного выше способа, и его семена. Растение может быть диким растением,но не ограничено им. Двудольным растением могут быть, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или, но не ограничено ими. В настоящем изобретении заявляется также способ получения трансформированного растения,имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу, включающий сверхэкспрессию модификации гена путем трансформации клетки растения рекомбинантным вектором по настоящему изобретению. В настоящем изобретении заявляется также трансформированное растение,имеющее повышенную устойчивость к солевому стрессу,которое получено с помощью описанного выше способа, и его семена. Растение может быть двудольным растением, но не ограничивается ими. Двудольное растение является таким, как описанные выше растения. В настоящем изобретении заявляется также способ получения трансформированного растения,имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу, включающий сверхэкспрессиюгена путем трансформации растительной клетки рекомбинантным вектором, включающимген, полученный из, который состоит из нуклеотидной последовательности 1. В настоящем изобретении заявляется также трансформированное растение,имеющее повышенную устойчивость к солевому стрессу,которое получено с помощью способа, описанного выше, и его семена. Растение может быть двудольным растением, но не ограничивается ими. Двудольное растение такое же, как те, что описаны выше. В настоящем изобретении заявляется также генетическая вставка для повышения содержания каротиноида в растении, содержащая 6 модификацию гена, имеющую специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный из,которая состоит из нуклеотидной последовательности 2. Генетическая вставка по настоящему изобретению включает в качестве действующей компоненты модификацию гена, состоящую из нуклеотидной последовательности 2, и при трансформации растения этой модификацией гена содержание каротиноида в растении может быть увеличено. В настоящем изобретении заявляется также генетическая вставка для повышения устойчивости к солевому стрессу растения, содержащего модификацию гена, имеющую специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный из,которая состоит из нуклеотидной последовательности 2. Генетическая вставка по настоящему изобретению включает в качестве действующей компоненты модификацию гена,состоящую из последовательности 2, и при трансформации растения этой модификацией гена устойчивость растения к солевому стрессу может быть повышена. В настоящем изобретении заявляется также генетическая вставка для повышения устойчивости к солевому стрессу растения, содержащегоген, полученный из, который состоит из нуклеотидной последовательности 1. Генетическая вставка по настоящему изобретению включает в качестве действующей компоненты ген,состоящий из нуклеотидной последовательности 1, и при трансформации растения этой модификацией гена устойчивость растения к солевому стрессу может быть повышена. Ниже приводится более подробное пояснение настоящего изобретения на Примерах. Однако очевидно, что приведенные Примеры даны только для иллюстрации настоящего изобретения, и оно никоим образом не ограничивается ими. Примеры Пример 1 Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности гена. Был приготовлен-праймер для клонирования-гена из. Праймер имеет следующую последовательность прямой праймер (533) и обратный праймер (5-34). Используя полученныйген в качестве шаблона, была выполнена перекрывающаяся ,для того, чтобы иметь искусственную мутацию специфической нуклеотидной последовательности в. Для вставки последовательности оснований,отвечающей последовательности,начинающейся с аминокислоты номер 133 в аминокислотной последовательности гена ,были приготовлены последовательность в используемых праймерах следующая прямой праймер(5-35) и обратный праймер (5- 36). В результате был получен продукт размером в 921 пару нуклеотидов, и он был скопирован в - - вектор. Наличие мутации вставки последовательности-,начинающейся с аминокислоты номер 133, было подтверждено путем выполнения секвенирования(Фиг.1).была выполнена с использованием полимеразной смеси 2 фирмы , и-продукт желаемых размеров был клонирован с использованием системы и затем секвенировался для определения полной нуклеотидной последовательности. Полученный в результате кДНК ген был назван-. Полная длина - гена по настоящему изобретению составила 924 пары нуклеотидов, и эта кДНК из 924 пар нуклеотидов кодирует 307 аминокислот (Фиг.1). Изоэлектрическая точкаи молекулярный вес , которые были установлены из аминокислотной последовательности, составили соответственно 8,45 и 33,74 к. К нуклеотидной последовательности описанных выше праймеров, к 5 концу каждого описанного выше праймера,были добавлены последовательности-адаптеры (большие буквы) так,чтобы можно было использовать технологию клонирования , производимую фирмой. Получены следующие нуклеотидные последовательности прямой праймер,полная нуклеотидная последовательность была проверена путем секвенирования. Полученная кДНК была названа-. Каждый из двухвекторов, в которые были скопированы соответственно генили ген -, были подвергнуты ВРреакции, чтобы клонировать гены в 207 векторе. После этого был сконструирован растительный экспрессионный вектор геновили -. Эти гены были клонированы в соответствии среакцией между 207 ивекторами, в результате чего был сконструирован растительный экспрессионный вектор (Фиг.3). Пример 2 Анализ фенотипа культуральных клеток, трансформированныхили -. Культуральные клетки кремово окрашенного батата сортабыли трансформированы растительным экспрессионным вектором Фиг.3 посредством . В результате было обнаружено, что нетрансформированныйимел кремовый цвет без существенных изменений, тогда как культуральные клетки,трансформированныеили -, имели сильно выраженный желтый цвет. Визуально было подтверждено, что - проявляет особенно сильный цвет (Фиг.4). Пример 3 Анализ содержания каротиноида в культуральных клетках,трансформированных векторомили . В результате исследования фенотипа культуральных клеток,трансформированных векторомили , было обнаружено, что нетрансформированные культуральные клеткиимели кремовый цвет,тогда как клетки, трансформированныеи-, имели фенотип сильно выраженного желтого цвета (Фиг.4). Содержание каротиноида в культуральных клетках каждого трансформированногобыло оценено с помощью(жидкостная хроматография высокого давления). В результате было найдено, что полное содержание каротиноида в культуральных клеткахбыло в 4 раза или более выше, чем в культуральных клетках .- продемонстрировал увеличение почти в 13 раз. В частности, содержание бета-каротина по сравнению с культуральными клеткамив культуральных клеткахбыло выше почти в 4 раза, а культуральные клетки демонстрировали увеличение в 10 раз или больше. Кроме того, культуральные клетки демонстрировали повышение содержания каротиноида в 3 раза или более по сравнению с культуральными клетками , а содержание бета-каротина также было выше в 2 раза или более(Фиг.5). Пример 4 Анализ экспрессии гена, относящегося к биосинтезу каротиноида, и гена . Для двух видов культуральных клеток трансформированного, включая, на основе - был выполнен анализ экспрессии гена, относящегося к биосинтезу каротиноида, и гена . Праймерные последовательности, используемые для анализа,были следующими прямой праймер(5-39) и обратный праймер (5- 310). В результате было найдено, что за исключениеми -, экспрессия гена,относящегося к биосинтезу каротиноида, вбыла очень слабой или отсутствовала. Культуральные клетки, трансформированные геном, тоже показывали практическое отсутствие экспрессии. Однако культуральные клетки,трансформированные-,показывали практически тот же самый уровень экспрессии, что и , за исключением сверхэкспрессии гена. Однако было также обнаружено, что в культуральных клетках, трансформированных , не только ген , но также - иимели более высокую экспрессию по сравнению с Пример 5 Анализ устойчивости к солевому стрессу культуральных клеток,трансформированныхили -.(3,3 диаминобензидин) связывается с Н 2 О 2 и образует коричневые преципитаты в клетках. Таким образом, в клетках отмечается сильное коричневое окрашивание при возрастании окислительного стресса. Культуральные клетки, трансформированныеили-, были погружены на 24 часа в жидкую питательную среду 1, содержащуюв концентрации 150 мМ или 200 мМ, и с помощью-окрашивания был определен окислительный стресс, испытываемый культуральными клетками. В результате, вбыло обнаружено, что при росте концентрации наблюдалось сильное коричневое окрашивание, и в результате измерения поглощения растворапри 460 нм был показан высокий уровень окислительного стресса. Однако культуральные клетки,трансформированныеили -,проявляли низкий окислительный стресс (Фиг.7). Основываясь на этих результатах,было подтверждено, что культуральные клетки, трансформированныеили -,проявляют устойчивость к . Пример 6 Анализ,трансформированногоили -. Был исследован фенотип семян, трансформированногоили . В результате было подтверждено, что трансформанты проявляют желтый цвет оболочки семян, сравнимый с диким типом (колонка-0), т.е. с нетрансформированным (Фиг.8). Фактическое изменение содержания каротиноида в, трансформированногоили -, определялось путем измерения содержания бета-каротина в ткани каждого из двух трансформированных . Содержание определяли с помощью спектрофотометра путем измерения поглощения на 440 нм. В результате было найдено, что между диким типом в качестве контрольной группы и, трансформированным ,существенной разницы нет. Однако в, трансформированном -, содержание бета- каротина возрастает в 1,5 раза или около этого(Фиг.8). Однако для более точного измерения содержания каротиноида полагается, чтобы было выполнено сравнение ткани, функционирующей будучи погруженной в жидкую среду. Далее, с помощью - в указанных выше трансформантах был определен профиль экспрессии генов, относящихся к биосинтезу каротиноида. В результате было получено, что между экспрессией известных генов, относящихся к биосинтезу каротиноида,и экспрессей экспрессировался только в трансформантах, тогда как в диком типе,являющемся контрольной группой,он не экспрессировался. На основании этих результатов 8 было подтверждено, что праймеры, используемые в настоящем изобретении, являютсяспецифичными (Фиг.9). Пример 7 Анализ экспрессии стрессиндуцируемогогена в,трансформированномили -. На дальнейших этапах пути биосинтеза каротиноида происходит синтез абсцизовой кислоты, являющейся представителем растительных гормонов. Абсцизовая кислота является одним из важных гормонов, которые включаются в процессе развития растения на таких этапах, как прорастание,состояние покоя, рост молодых растений или им подобных, и она играет ключевую роль в преодолении стресса,вызванного засухой,низкотемпературного стресса и им подобных. В настоящем изобретении для определения индуцирования синтеза абсцизовой кислоты,вызванного возросшим содержанием каротиноида в, трансформированном ,был проведен анализ экспрессии . Известно,что вимеется девятьгрупп, и их экспрессия возрастает в ответ на повышенное содержание абсцизовой кислоты и стресс (., 2006). В результате проведения - было обнаружено, что экспрессия 1 была высокой во всех трех трансформантах и в контрольной группе. Однако 3, 6 и 4 дают картину более высокой экспрессии в,трансформированном -, по сравнению с контрольной группой. Таким образом, на основе этого результата предполагается,что трансформанты,трансформированные -, проявляют высокую устойчивость к высокому содержанию абсцизовой кислоты и стрессам, обусловленным условиями окружающей среды, таким как солевой стресс,стресс, вызванный засухой, осмотический стресс(Фиг.10). Пример 8 Анализ фенотипа,трансформированногоили -, после обработки .является наиважнейшей причиной стресса при развитии и росте растения. При стрессе,вызванном , сначала вызывается дегидратация и потеря тургора клеток, и поэтому стресс,вызванный недостатком воды, и стресс, вызванный, являются сторонами одного и того же механизма. Однако в реальных растительных клетках стресс, вызванный , оказывает больший эффект дегидратации, чем стресс,вызванный недостатком воды. Чтобы подтвердить,повышает ли в действительностиустойчивость к стрессу, вызванному , на уровне растения,, трансформированныйили -, культивировали в течение 2 недель в питательной твердой средеполовинной концентрации (1/2 ), содержащей 50, 100 или 150 мМ . Через семь дней после посева исследовалась скорость прорастания. В результате было найдено, что трансформанты проявляют более высокую скорость прорастания по сравнению с контрольной группой, даже когда концентрациявозрастает (Фиг.11). Кроме того, хотя биомасса дикого типа, являющегося контрольной группой, значительно снижалась с ростом концентрации,трансформированныйили -, имел большую биомассу по сравнению с контрольной группой (Фиг.12). Далее, в условиях концентрации , равной 100 мМ,, трансформированныйили -, имел более длинные первичные корни по сравнению с контрольной группой. В частности, - имел первичные корни по крайней мере в два раза более длинные,чем в контрольной группе. При высоких концентрациях,трансформированный , проявлял фенотип с более длинными первичными корнями по сравнению с контрольной группой (Фиг. 13). Далее, измерялось относительное содержание воды при концентрации , равной 150 мМ. В результате было получено, что содержание воды в контрольной группе составляло около 70 при концентрации 150 мМ, тогда как, трансформированныйили , имел существенное отличие по сравнению с необработанной группой. Таким образом, можно полагать,что,трансформированныйили -, имеетвысокий показатель связывания воды в условиях высокой концентрации соли. В связи с более высоким относительным содержанием воды он может лучше выживать даже во внешних условиях с высоким уровнем содержания соли(Фиг.14). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. - модификация гена, состоящая из нуклеотидной последовательности 2,которая содержит специфическую нуклеотидную последовательность, вставленную вген,полученный из. 2. Рекомбинантный вектор,содержащий модификацию гена по п.1. 3. Клетка-хозяин,трансформированная рекомбинантным вектором по п.2. 4.Способ получения трансформированного растения, имеющего повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу, включающий сверхэкспрессию- модификации гена путем трансформации растительной клетки рекомбинантным вектором по п.2. 5. Трансформированное растение, имеющее повышенное содержание каротиноида или повышенную устойчивость к солевому стрессу,полученное с помощью способа по п.4. 6. Трансформированное растение по п.5, в котором растением является двудольное растение. 7. Способ получения трансформированного двудольного растения, имеющего повышенную устойчивость к солевому стрессу, включающий сверхэкспрессию гена путем трансформации растительной клетки рекомбинантным вектором, включающимген, полученный из, который состоит из нуклеотидной последовательности 1. 8. Трансформированное двудольное растение,имеющее повышенную устойчивость к солевому стрессу, полученное по способу п.7. 9. Генная вставка для повышения содержания каротиноида в растении, включающая модификацию гена, имеющую специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный из, которая состоит из нуклеотидной последовательности 2 10. Генная вставка для повышения устойчивости к солевому стрессу растения, включающаяген, полученный из, который состоит из нуклеотидной последовательности 1 или - модификацию гена,имеющую специфическую нуклеотидную последовательность, искусственно вставленную вген, полученный из,которая состоит из нуклеотидной последовательности 2.