Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами

(51) 61 9/19 (2006.01) 61 38/48 (2006.01) 61 41/00 (2006.01) А 61 К 47/48 (2006.01) 12 11/08 (2006.01) 61 7/02 (2006.01) 61 9/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Описывается фармацевтическая композиция,обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами. Композиция содержит активные протеазы,присоединенные к гелю или к смеси геля с воднорастворимым полимером, причем указанное присоединение выполнено с помощью радиации,предпочтительно гамма-излучения,или ускоренными электронами. В качестве протеаз композиция содержит протеазы, стабильные при температуре до 70 С, более предпочтительно при 30-40 С, например, такие, как субтилизин, трипсин,химотрипсин, папаин или стрептокиназа. Гелем предпочтительно является полиэтиленгликолевый гель, декстрановый или полигликановый, а водорастворимым полимером является полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, декстран или полигликан. Раскрывается также способ получения указанной композиции и ее применение. Преимущества заявляемая композиция обладает широкой областью применения и может быть использована в кардиологии, нефрологии, хирургии,ревматологии, гинекологии и гастроэнтерологии.(72) Артамонов Андрей ВладимировичВерещагин Евгений ИвановичГришин Олег ВитальевичТроицкий Александр Васильевич(73) Закрытое акционерное общество АКСИС 16574 Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии и лекарственным средствам на основе ферментных препаратов, и может быть использовано в комплексной терапии ишемической болезни сердца, ишемических инсультов мозга,ревматоидных процессов и других заболеваниий,сопровождающихся явлениями ишемии,тромбообразования и неспецифического воспаления. Это изобретение охватывает область ферментативного гидролиза белков, образующих тромб, в основном фибрина, структурообразующего белка всех тромбов независимо от локализации и размеров пептидов. Более конкретно, изобретение касается соединений, содержащих протеолитические ферменты, обладающих фибринолитическими свойствами, иммобилизованных (присоединенных) к гидрофильным водорастворимым полимерам. Изобретение также связано с методами использования таких соединений для фибринолитической терапии при лечении острых инфарктов миокарда, ишемических инсультов мозга, а также терапевтическими методами,направленными на коррекцию(улучшение) гемореологических показателей при лечении ишемических повреждений органов и тканей различной этиологии, в том числе вследствие микротромбообразования. Известны различные лекарственные препараты,применяемые для лечения ишемической болезни сердца и ишемических инсультов мозга. Как правило, в финальной стадии этих заболеваний основным патогенетическим фактором является образование внутрисосудистых тромбов. В современной медицинской практике для лечения острых инфарктов миокарда и ишемических инсультов мозга широкое распространение получили тромболитические лекарственные препараты как средства этиотропной терапии. Известны фармацевтические препараты, такие, как стрептаза, стрептокиназа, тканевой активатор плазминогена(Методические рекомендации по проведению ранних лечебных мероприятий пациентам с острым инфарктом миокарда. Сообщение Американского кардиологического колледжа и Американской ассоциации сердца // Сб. под ред. В.И. Ганюкова. Новосибирск, 1998, с. 100). Все они напрямую или в результате активации противосвертывающей системы крови воздействуют на фибрин, приводя к его деструкции и, соответственно, лизису внутрисосудистого тромба. Несмотря на высокую терапевтическую эффективность, они обладают выраженным побочным действием, а именно они способны вызывать неконтролируемые и опасные кровотечения, так как истощают свертывающую систему крови ( //., 1994, . 343, . 311-322). Кроме того,для таких препаратов, как стрептокиназа и альтеплаза,сложно подобрать адекватную терапевтическую дозу, так как в организме человека имеется индивидуальный титр антител к 2 стрептококку, приводящий к инактивации этих препаратов. Известны лекарственные препараты, обладающие способностью снижать воспалительную реакцию. Из них наибольшее распространение получили нестероидные противовоспалительные препараты, такие, как аспирин, индометацин,диклофенак натрия и другие (Насонов Е.Л.,Цветкова , Тов Н.Л. Селективные ингибиторы циклооксигеназы-2 новые перспективы лечения заболеваний человека // Тер. архив, 1998,5, с. 814). Известные фармацевтические препараты обладают существенными недостатками, а именно способностью вызывать повреждения желудка с развитием нестероидной гастропатии, геморрагиями и изъязвлениями слизистой желудочно-кишечного тракта. Известны фармацевтические препараты,обладающие цитопротективными свойствами, такие,как предуктал (кардиопротективное действие) и блокаторы Н 2 рецепторов (гастроцепин, ранитидин). Известные препараты обладают слабым цитопротективным действием и проявляют фармакологическое действие при длительном применении ( ,.,.// .,1990, . 11, . 207-212). В настоящее время в научной и медицинской литературе нет данных по созданию фармацевтических композиций,обладающих многоцелевым синергичным воздействием на основные патогенетические звенья ишемии,воспаления и тромбообразования в сочетании с цитопротективными свойствами. Сообщалось о различных методах иммобилизации ферментов, включая протеазы, на ряде полимерных носителей. Например, в работе Р.И. Салганика и др. Иммобилизованные протеолитические ферменты в лечении гнойных процессов, Новосибирск, с. 3-8 (1981) описан способ лечения гнойных ран, абсцессов и флегмон протеолитическими ферментами, присоединенными ковалентно к твердым гранулам целлюлозы. Применение жидких полимеров с присоединенными протеазами описано О.А. Перетягиным и др. в журнале Офтальмология, 1987,3, с. 145-148 и Гончаром и др., Ветеринария, 1989,4, с. 52-55. В большинстве случаев был использован бифункциональный химический реагент как связывающий агент, у которого одна химическая группа соединялась с аминокислотным остатком ферментного белка, в то время как другая реакционная группа связывалась с полимерным носителем. Был исследован ряд химических процедур для ковалентного присоединения различных ферментов к твердым носителям. Однако протеазы, присоединенные к твердым гранулам или волокнам, неспособны лечить повреждения или заболевания,приводящие к формированию внутрисосудистых тромбов и сопровождающиеся негативными изменениями гемореологии в микроциркуляторном русле тканей и органов. 16574 Таким образом, необходимы соединения,которые эффективно гидролизуют белки,преимущественно образующие тромбы в сосудах различного 103/4 диаметра, которые являются этиологическим фактором развития таких заболеваний, как острый инфаркт миокарда и ишемический инсульт мозга. Эти соединения,содержащие нетоксичные тромболитики и вещества с гемореологическими коррегирующими функциями, в настоящее время не синтезированы для комплексной терапии ишемической болезни сердца, гипертонической болезни и ревматоидных заболеваний. Также необходимы простые,недорогие и удобные методы одновременного присоединения протеаз к комплексу полимерных носителей, обеспечивающие одновременно и стерилизацию конечного продукта. Идеальны методы, которые могут производить соединения различной вязкости и агрегатного состояния,которые пригодны для различных целей и различных путей введения. Представляемое исследование удовлетворяет этим требованиям,а также обеспечивает относительные преимущества перед другими лекарственными препаратами и способами получения фармацевтических композиций,обладающих комплексным синергичным терапевтическим действием на различные звенья патогенеза ишемической болезни сердца. Также представляемое исследование,заявляемая фармацевтическая композиция и способы ее получения позволяют обеспечить высокий терапевтический эффект при лечении неспецифических воспалительных процессов за счет цитопротективного,тромболитического и антиишемического эффектов. Представляемое изобретение направлено на создание композиций для селективного гидролизиса белков, формирующих тромб, состоящих из активных протеаз, присоединенных к комбинации гидрофильных водорастворимых полимеров. Композиции преимущественно состоят из субтилизинов, иммобилизованных на гидрофильных полимерах. Изобретение способствует развитию методов изготовления таких композиций присоединением протеаз к водорастворимым полимерам с образованием смеси и одновременной стерилизацией смеси с помощью радиационного излучения, в частности, с помощью потока ускоренных электронов или гамма-излучения, а также других видов ионизирующего излучения,включая источники лазерного излучения. Представляемое изобретение направлено на новые фармацевтические композиции для гидролизиса белков, образующих тромб, состоящие из активных протеаз,присоединенных к гидрофильным полимерам. Такие композиции полезны для удаления тромбов, которые включают фибрин и другие образования. Представляемое изобретение также направлено на новые соединения для коррекции патологических изменений в тканях и органах, возникших в результате тромбообразования и ишемии, а также на коррекцию неспецифических воспалительных реакций и как вспомогательное средство для лечения и профилактики гастропатий, развивающихся вследствие применения нестероидных противовоспалительных препаратов. Иммобилизованные на водорастворимых гидрофильных полимерах протеазы представляемого изобретения селективно деградируют белки тромбов, в основном фибрина, в то время как живые клетки и функционально активные белки остаются интактными и неповрежденными. Для эффективного гидролиза белков тромботических масс предпочтительна полифункциональная смесь протеаз, способных распознавать и гидролизовать различные пептидные связи. Природные протеазы включают,например,субтилизин,трипсин,химотрипсин, папин и другие ферменты животного и бактериального происхождения, обладающие фибринолитической и протеолитической активностью. Хотя протеазы могут быть получены из любых источников, включая животные и растительные протеазы, особенно предпочтительны бактериальные протеазы. По сравнению с другими типами протеаз, бактериальные протеазы обычно менее дорогие и обычно доступны в нелимитированных количествах. Предпочтительные бактериальные протеазы представляемого изобретения могут продуцироваться . и известны как субтилизины. Смесь нейтральных и(или) щелочных субтилизинов является предпочтительной, так как смесь может селективно разрушать ряд различных пептидных связей и сохранять активность в диапазоне рН от 6,0 до 10,0. Протеазы представляемого изобретения присоединяются к комбинации водорастворимых полимеров, которые действуют как носители для протеолитических ферментов. Водорастворимыми полимерами являются более предпочтительно полиэтиленоксид, син. полиэтиленгликоль (ПЭО),имеющий молекулярную массу 1500 кДа (ПЭО 1500), и декстран, имеющий молекулярную массу 30-40 кДа. Полиэтиленоксиды и декстраны с меньшей или с большей молекулярной массой также могут быть использованы вместо или вместе с ПЭО 1500 и декстраном с молекулярной массой 30-40 кДа. Другие подходящие водорастворимые полимеры и их комбинации, которые также могут быть использованы,включают,например,поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и подобные им. Композиции предлагаемого изобретения могут находиться в любой нетвердой или твердой форме или в комбинации агрегатных форм. Предпочтительно,в качестве композиций используют лиофилизированные порошки(субстанции) в различных комбинациях с водорастворимыми полимерами в зависимости от того, в какой области планируется использование соединения. Для обеспечения суммарных терапевтических свойств к данной композиции могут быть добавлены антитела,терапевтические обеззараживающие 3 16574 агенты, глюкокортикоиды, стимуляторы тканевой регенерации и другие терапевтические агенты. Для пользы дела такие агенты не следует смешивать в значительном количестве с протеазами без уточнения(исследования) их влияния на специфическую и терапевтическую активность заявляемой фармацевтической композиции. Настоящее изобретение в также направлено на методы изготовления композиций путем присоединения протеаз к водорастворимым полимерам и одновременной стерилизации смеси радиацией. Предпочтительными видами радиации являются ускоренные электроны или гаммаизлучение. Вкратце технология выглядит следующим образом раствор смеси протеаз, предпочтительно субтилизинов, и водорастворимых полимеров,предпочтительно полиэтиленоксида и декстрана,подвергается воздействию электронов, испускаемых ускорителем электронов в дозе,которая способствует присоединению к полимерному носителю и одновременно стерилизации получающегося соединения. С другой стороны,гамма-лучи, испускаемые Со-60, могут быть использованы вместо пучка электронов с обеспечением пришивки компонентов и стерилизации. Достаточная доза радиации может быть подобрана специалистом в данной области из расчета обеспечения стерильности смеси при несущественном воздействии на протеолитическую активность ферментов. Наконец, представляемое изобретение также направлено на способы очищения сосудистого русла от тромбов путем управления или применения эффективных количеств заявляемой композиции для удаления этого материала. Композиции представляемого изобретения эффективны при использовании в качестве препаратов для фармацевтических целей в различных направлениях и областях, таких, как медицина, стоматология,ветеринарная медицина и персональный уход. В связи с этим композиции настоящего изобретения особенно пригодны для лечения ишемической болезни сердца и ее осложнений, а также ишемических инсультов мозга, ревматоидных заболеваний и других заболеваний, в патогенезе которых имеется воспалительная реакция, ишемия тканей, нарушение гемореологии и сосудистой микроциркуляции из-за тромбообразования. Заявляемая фармацевтическая композиция также пригодна для ферментативной деструкции вязких биологических жидкостей,таких,как секретируемые слизи (например бронхиальный секрет), поэтому она эффективна в лечении легочных заболеваний для профилактики и лечения бронхиальной обструкции. Заявляемая фармацевтическая композиция также пригодна для ферментативной деструкции белков и пептидов некротических тканей, всегда присутствующих при травматических и инфекционно-воспалительных процессах, поэтому она эффективна в лечении гнойно-воспалительных заболеваний различной этиологии и локализации. 4 Эти композиции могут быть приложены к очагу поражения любым методом, известным в медицине. Такие методы включают, например, парэнтеральное введение, внутриполостное и наружное применение,аэрозольное распыление, спринцевание через троакар, катетеры, бронхоскоп или другое подходящее применение. Метод введения будет зависеть, по крайней мере частично, от природы пораженной области и от типа и количества тромбообразующих или некротических тканей,которые надо удалить. Преимущественным путем введения является парэнтеральный способ введения препарата (композиций). Краткое описание рисунков. Фиг. 1 демонстрирует тромболитические свойства заявленной композиции, исследованные на модели лизиса тромба. Заявленная композиция достоверно превосходит в стандартной лечебной дозе (50 ФЕ/мл) фибринолизин (р 0,02),трипсин (р 0,01) и спонтанный лизис тромба в физиологическом растворе (р 0,01). Фиг. 2 демонстрирует, что с увеличением возраста тромба до 7 суток тромболитические свойства заявленной композиции сохраняются. Фибролизин не действует на 7-суточный тромб. В течение первых двух часов действие фибролизина на тромб достоверно не отличается от спонтанного фонового лизиса в физиологическом растворе. К концу 4-го часа заявленная композиция полностью растворяет тромб, в то время как фибринолизин лизирует только 20 массы старого тромба. Фиг. 3 демонстрирует противовоспалительные свойства заявленной композиции, исследованные на модели индукции медиатора воспаления - фактора некроза опухолей (ФНО) у мышей линии СВА при эндотоксическом шоке. Активность ФНО измеряли с использованием линии клеток 929 и выражали в единицах действия (ЕД). 1 - активность ФНО у интактных животных 2 - активность ФНО у животных после введения эндотоксина 3 - активность ФНО у животных, которым за час до введения эндотоксина введена заявленная композиция. Видно, что заявленная композиция снижает активность ФНО в 50 раз. Фиг. 4 демонстрирует цитопротективные свойства заявленной композиции, изученные на модели адреналинового миокардита у крыс. Представлены данные гистологического морфометрического исследования объема некрозов и дистрофических изменений в миокарде у крыс. Объем поражений определяли планиметрически и выражали вобъемной плотности, которая равна отношению объема поражений к общему объему ткани, умноженной на 100 . К некрозы - контрольные животные, которым после введения адреналина в/брюшинно вводили 1 мл изотонического раствора 2 раза/сутки ТБР некр. - опытные животные, которым после введения адреналина в/брюшинно вводили 1 мл заявленной композиции 2 раза/сутки. 16574 Первые два столбца демонстрируют положительный эффект (снижение количества некрозов в сердечной мышце примерно в 1,5 раза) заявленной композиции к концу третьего дня обработки животных. Вторые два столбца демонстрируют положительный эффект(уменьшение дистрофических изменений в сердечной мышце примерно в 2,5 раза) заявленной композиции к концу седьмых суток обработки животных. Следующие ниже примеры предназначены для иллюстрации состава, способа получения и фармакологических свойств заявляемой композиции,однако представляемое изобретение не ограничивается ими. Предпочтительные варианты выполнения изобретения. Пример 1. Предлагаемую фармацевтическую композицию получают следующим образом готовят реакционную смесь путем растворения протосубтилина, преимущественно протосубтилина ГЗХ и полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 400-20000 Да (преимущественно 1500 Да), в растворе декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа (преимущественно 40 кДа) в 0,025 М натрийфосфатном буферном растворе с рН 7,5-8,2. Полученную смесь очищают путем удаления балластных белков методом солевого осаждения и последующего фильтрования. Полученный раствор подвергают облучению гамма-лучами или потоком ускоренных электронов (с энергией 2,0 МэВ) в дозе 0,5-1,5 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют по 10 мл во флаконы вместимостью 15 мл. Затем раствор высушивают методом лиофилизации до остаточной влаги не более 2 . В результате получают композицию, содержащую иммобилизованный на полиэтиленоксиде и декстране протеазный комплекс из Протеолитическая активность полученной композиции в одном флаконе составляет от 500 до 1000,0 ПЕ/г. Композиция представляет пористую однородную массу слегка желтоватого цвета. Для терапевтических целей используют раствор заявляемой композиции(условное название Тромбовазим), который готовят,растворяя содержимое флакона в 10 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия или в 10 мл воды для инъекций. Пример 2. Заявляемая композиция может быть получена другим способом, а именно раздельным изготовлением активного компонента (1 компонент),содержащего комплекс иммобилизованных на полиэтиленоксиде и декстране протеаз и растворителя - раствора полиэтиленоксида (2 компонент). Двухкомпонентный состав композиции позволяет варьировать активностью заявляемой фармацевтической композиции за счет изменения соотношения активный компонент - растворитель,что позволяет подбирать индивидуальные схемы лечения. Двухкомпонентную композицию получают следующим образом 1 компонент (активное вещество) готовят реакционную смесь путем растворения протосубтилина (преимущественно протосубтилина ГЗХ) и полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 400-20000 Да (преимущественно 1500 Да) в растворе декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа (преимущественно 40 кДа) в 0,025 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,5-8,2. Полученную смесь очищают путем удаления балластных белков методом солевого осаждения и последующего фильтрования. Полученный раствор подвергают облучению гамма-лучами или потоком ускоренных электронов (с энергией 2,0 МэВ) в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют по 10 мл во флаконы вместимостью 15 мл. Затем раствор высушивают методом лиофилизации до остаточной влаги не более 2 . В результате получают(1) компонент композиции, содержащий иммобилизованный на полиэтиленоксиде и декстране протеазный комплекс из Протеолитическая активность полученной композиции в одном флаконе составляет от 500 до 1000,0 ПЕ/г. Компонент 1 представляет собой пористую однородную массу слегка желтоватого цвета.(2) компонент (растворитель) готовят раствор полиэтиленоксида (преимущественно полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500 Да) в 0,025 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,5-8,2. Полученный раствор подвергают облучению гамма-лучами или потоком ускоренных электронов (с энергией 2,0 МэВ) в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют по 10 мл во флаконы вместимостью 15 мл. В результате получают стерильный растворитель для (1) компонента заявляемой композиции. Растворитель представляет собой жидкость слегка желтоватого цвета. Для терапевтических целей используют раствор заявляемой композиции(2) компонента (растворителя). При растворении 1 компонента в растворителе (2 компонент) и последующей лиофилизации получают заявляемую фармацевтическую композицию. Пример 3. 15 г полиэтиленоксида 1500 растворяют в 300 мл 10 декстрана с молекулярной массой 40 кДа в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,5,добавляют 6,3 г протосубтилина ГЗХ, смесь перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,455 16574 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63. После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре от 4 до 8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 . В результате получают композицию следующего состава в мас.1. Протосубтилин ГЗХ 2,1 2. Декстран (молекулярная масса 40 кДа) 10,0 3. Полиэтиленоксид 1500 5,0 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 82,9. Протеолитическая активность композиции - 850 ПЕ/г. Пример 4. 15 г полиэтиленоксида 1500 растворяют в 300 мл 5 раствора декстрана с молекулярной массой 40 кДа в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2, добавляют 6,0 г протосубтилина ГЗХ, смесь перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,45 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63 . После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре 4-8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 . В результате получают композицию следующего состава в мас. 1. Протосубтилин ГЗХ 2,0 2. Декстран (молекулярная масса 40 кДа) 5,0 3. Полиэтиленоксид 150 5,0 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 88,0. Протеолитическая активность композиции - 800 ПЕ/г. Пример 5. 0,5 г полиэтиленоксида 1500 растворяют в 300 мл 10 раствора декстрана с молекулярной массой 40 кДа в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2, добавляют 5,7 г протосубтилина ГЗХ, смесь перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в 6 смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,45 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63 . После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция,который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре 4-8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 .В результате получают композицию следующего состава в мас. 1. Протосубтилин ГЗХ 1,9 2. Декстран (молекулярная масса 40 кДа) 10,0 3. Полиэтиленоксид 1500 0,5 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 87,6. Протеолитическая активность композиции - 750 ПЕ/г. Пример 6. 15 г полиэтиленоксида 4000 растворяют в 300 мл 5 раствора декстрана с молекулярной массой 40 кДа в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2, добавляют 7,5 г протосубтилина Г 10 Х, смесь перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,45 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63 . После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция,который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре 4-8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,2 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 . В результате получают композицию следующего состава в мас. 1. Протосубтилин Г 10 2,5 2. Декстран (молекулярная масса 40 кДа) 5,0 3. Полиэтиленоксид 4000 5,0 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 87,5. Протеолитическая активность композиции - 500 ПЕ/г. Пример 7. 15 г полиэтиленоксида 4000 растворяют в 300 мл 5 раствора декстрана (мол. масса 70 кДа) в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2,добавляют 7,5 г протосубтилина Г 10 Х, смесь 16574 перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,45 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63 . После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция,который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре от 4 до 8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 0,8 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 . В результате получают композицию следующего состава в мас. 1. Протосубтилин Г 10 2,5 2. Декстран (молекулярная масса 70 кДа) 5,0 3. Полиэтиленоксид 4000 5,0 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 87,5. Протеолитическая активность композиции - 1000 ПЕ/г. Пример 8. Получение заявляемой композиции, состоящей из активного компонента и растворителя(1) компонент 0,5 г полиэтиленоксида 1500 растворяют в 300 мл 10 раствора декстрана с молекулярной массой 40 кДа в 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2, добавляют 5,7 г протосубтилина ГЗХ,смесь перемешивают при температуре 18-20 С в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков методом солевого осаждения. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного до конечной концентрации 0,45 и 1,9 г хлорида кальция до конечной концентрации 0,63 . После растворения хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре от 4 до 8 С для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры (белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл и лиофильно высушивают до остаточной влаги не более 2 .В результате получают (1) компонент композиции следующего состава в мас. 1. Протосубтилин ГЗХ 1,9 2. Декстран (молекулярная масса 40 кДа) 10,0 3. Полиэтиленоксид 1500 0,5 4. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 87,6.(2) компонент (растворитель) 15,0 г полиэтиленоксида 1500 растворяют в 300 мл 0,025 М натрий-фосфатного буфера с рН 8,2. Далее раствор фильтруют через бумажные фильтры(белая лента). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный раствор подвергают облучению гаммалучами в дозе 1,0 Мрад. После облучения раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют по 10 мл во флаконы емкостью 15 мл. В результате получают (2) компонент композиции следующего состава в мас. 1. Полиэтиленоксид 1500 5,0 2. 0,025 М Натрий-фосфатный буфер 95,0. При растворении 1 компонента в растворителе(2) компонент) и лиофилизации получают заявляемую фармацевтическую композицию. Пример 9. Исследование фармакологических свойств заявляемой композиции (тромбовазим) Фармакологические свойства заявляемой композиции (условное название тромбовазим) проверены в лабораторных условияхи. Тромболитические свойства композиции исследованы на модели лизиса тромба(фиг. 1). Из представленного рисунка следует, что тромбовазим обладает резковыраженным тромболитическим действием, достоверно превосходящим в стандартной лечебной концентрации - 50 ФЕ/мл фибринолизин (р 0,02), трипсин (р 0,01) и спонтанный лизис тромба в физиологическом растворе (р 0,01). Следует отметить, что с увеличением возраста тромба до 7 суток тромболитические свойства тромбовазима сохраняются(рисунок 2), при этом фибринолизин практически не действует на 7-суточный тромб. В течение первых двух часов действие фибринолизина на тромб достоверно не отличается от спонтанного фонового лизиса в физиологическом растворе. К концу 4-го часа тромбовазим полностью растворяет тромб, в то время как фибринолизин за это время лизирует только 20 массы старого тромба. Известно, что фибринолизин является самым активным фибринолитиком (2), а такие препараты,как стрептокиназа, урокиназа, альтеплаза и тканевой активатор плазминогена, являются непрямыми фибринолитиками, и их тромболитическое действие опосредовано активацией системы фибринолиза и выработкой эндогенного фибринолизина, который и приводит к лизису сформировавшегося тромба (1). Специфическую тромболитическую активность тромбовазимаисследовали на модели тромбоза сонной артерии, вызываемой аппликацией хлористого железа у крыс. В табл. 2 представлены результаты влияния профилактического введения тромбовазима (80 ПЕ на животное) на кровоток (мл/мин) по ипсилатеральным сонным артериям после аппликации хлористого железа (0-15 мин) у крыс линии . 7 Как видно из представленных результатов,профилактическое введение тромбовазима эффективно ограничивает процесс тромбообразования в сонной артерии в первые 1,5 часа после воздействия на нее хлоридом двухвалентного железа. Как видно из представленных результатов,лечебное введение тромбовазима эффективно тормозит процесс тромбообразования в сонной артерии в первые 1,5 часа после воздействия на нее хлоридом двухвалентного железа. Кроме того,гистологические (морфометрические) исследования показали, что при терапевтическом введении тромбовазима через 24 часа в 3 раза снижается доля животных с полной окклюзией сонной артерии и наличием в ней тромба, что свидетельствует о выраженной тромболитической активности препарата. Противовоспалительные свойства заявляемой композиции исследованы на модели индукции одного из основных медиаторов воспаления фактора некроза опухолей (ФНО) у мышей линии В табл. 3 представлены результаты влияния лечебного введения тромбовазима (80 ПЕ на животное) на кровоток(мл/мин) по ипсилатеральным сонным артериям после аппликации хлористого железа (0-15 мин) у крыс линии . Таблица 3 45 мин 2,10,7 1,70,4 СВА при эндотоксиновым шоке (фиг. 3). Активность ФНО измерялась биологическим способом с использованием линии клеток 929 и выражалась в единицах действия (ЕД). На рисунке представлена активность ФНО у интактных животных (1) и после введения эндотоксина (2). Введение тромбовазима за 1 час до введения эндотоксина (3) снижает в 50 раз активность ФНО,что доказывает противовоспалительные свойства тромбовазима. Цитопротективные свойства тромбовазима изучены на модели индометациновой гастропатии Контроль 6,2 мг индометацина в/желудочно Опыт 6,2 мг индометацина в/желудочно за 1 животного за 1 час до экспериментального воздействия час до экспериментального воздействия в группе в/брюшинного введения 3 мл в/брюшинного введения 3 мл Тромбовазима физиологического раствора желудка,геморрагии,геморрагии, поражений желудка, поражений ММ мм 2 ММ мм 2 792106 26,89,9 3,51,5 715151 9,89,0 1,31,2 Из представленной таблицы следует, что группы крыс, контрольная и опытная, сопоставимы по общей площади желудков- показатель не имел достоверного различия. Площадь кровоизлияний в группах достоверно различалась в группе с предварительным введением тромбовазима (опыт)в 3 раза меньше, чем в контроле (р 0,01). Такое 8 же достоверное соотношение наблюдается при сравнении относительной площади поражения . Таким образом,тромбовазим обладает выраженным цитопротективным действием при индометациновом поражении слизистой желудка. На фиг. 4 представлены данные гистологического морфометрического исследования 16574 объема некрозов и дистрофических изменений в миокарде у крыс с адреналиновым миокардитом. Объем поражений определялся планиметрически и выражался вобъемной плотности, которая равна отношению объема поражений к общему объему ткани, умноженной на 100. После введения адреналина в группе контроля (К) в/брюшинно вводился изотонический раствор 1,0 мл 2 раза/сутки, а в опытной группе (ТРБ) - тромбовазим 1 мл 2 раза/сутки. Из представленных результатов следует, что после развития адреналинового миокардита лечение тромбовазимом достоверно снижает количество некрозов в сердечной мышце к концу 3-х суток в 1,5 раза (ТРБ некр) в сравнении с контролем (К некрозы). Дистрофические изменения в сердечной мышце в группе опыта (ТРБ дистр) к концу 7-х суток достоверно в 2,5 раза меньше, чем в контрольной группе (К дистроф). Результаты, представленные в табл. 1 и на фиг. 4,доказывают, что тромбовазим обладает выраженным кардиопротективным и цитопротективным действием. Достоверно проявляется защитный эффект тромбовазима при специфической гастропатии, вызываемой нестероидными противовоспалительными препаратами,в частности индометацином, и лечебный эффект при остром адреналиновом миокардите, в патогенезе которого ключевую роль играет острая ишемия, некроз с развитием дистрофии миокарда. Дезинтоксикационный, антиишемический и цитопротективный эффекты исследовали также на модели ишемии/реперфузии печени. Для этого в опытной и контрольной группе крыс линии(по 10 крыс в группе) животным после лапаротомии на 20 минут пережимали печеночную триаду, т. е. полностью блокировали региональное лимфо- и кровообращение. Затем кровоток восстанавливали и у животных исследовали гистологическую структуру печени (основным количественным критерием являлась аккумуляция лейкоцитов в региональных лимфоузлах как показатель реакции на цитотоксическое повреждение ткани печени продуктами ишемии/реперфузии - перекисями и свободными радикалами). Результаты исследования представлены на фиг. 5. Как видно из представленных результатов,тромбовазим оказывает гепатопротекторное действие на модели ишемии/реперфузии печени,дополнительно подтверждает его цитопротективные, дезинтоксикационные и противовоспалительные свойства. Хотя описание данного изобретения имеет рекомендательный характер для настоящего предпочтительного использования, следует понимать,что различные модификации могут быть сделаны без отклонения от смысла данного изобретения. Таким образом, изобретение ограничено только следующей формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными, дезинтоксикацион ными и цитопротекторными свойствами для лечения заболеваний сопровождающихся ишемией,тромбообразованием, интоксикацией, воспалением,состоящая из множества активных протеаз,иммобилизованных на смеси водорастворимых полимеров, полученная путем одновременной иммобилизации указанного множества протеаз на водорастворимых полимерах с помощью облучения ионизирующим излучением водного раствора,содержащего множество протеаз и смесь водорастворимых полимеров. 2. Композиция по п.1, которая получена с помощью ионизирующего излучения, выбранного из потока ускоренных электронов, гамма-излучения или УФ-излучения. 3. Композиция по п.1, которая в качестве указанных активных протеаз содержит протеолитические ферменты, полученные из микробиологического,животного или растительного сырья. 4. Композиция по п.3, которая в качестве активных протеаз содержит протеолитические ферменты продуцируемые. 5. Композиция по п.1, которая в качестве смеси водорастворимых полимерных носителей для иммобилизации активных протеаз содержит смесь полиэтиленоксида и декстрана. 6. Композиция по п.1, которая представляет собой однокомпонентную лекарственную форму,содержащую лиофилизированные активные протеазы,иммобилизованные на смеси полиэтиленоксида и декстрана, а также комбинации с аспирином, индометацином и диклофенаком. 7. Композиция по п.1, которая представляет собой двухкомпонентную лекарственную форму,содержащую лиофилизированные активные протеазы,иммобилизованные на смеси полиэтиленоксида с декстраном и растворитель. 8. Композиция по п.7, которая в качестве растворителя содержит активированный ионизирующим излучением раствор полиэтиленоксида. 9. Композиция по п.1, которая является эффективным терапевтическим агентом для лечения ишемической болезни сердца и острых инфарктов миокарда, ишемических нарушений мозгового кровообращения,артериальных и венозных тромбозов, обструктивных заболеваний легких,гастритов и язвенной болезни желудка,гинекологических,и стоматологических заболеваний. 10. Композиция по п.9, которая для достижения терпевтического эффекта доставляется путем парэнтерального, перорального, внутривенного и местного введения. 11. Композиция по п.1, оказывающая защитный эффект на слизистую желудка при совместном применении с нестероидными анальгетиками. 12. Способ получения композиции по п.1,включающий одновременное присоединение активных протеаз к смеси водорастворимых полимеров для образования нетвердой смеси и стерилизацию смеси ионизирующим излучением. 9 16574 13. Способ по п. 12, в котором в качестве ионизирующего излучения применяют поток ускоренных электронов, гамма-излучение или УФизлучение. 14. Способ по п. 13, в котором используют в качестве протеазы - субтилизин, а в качестве водорастворимого полимера - полиэтиленгликоль. 15. Способ гидролиза белков, заключающийся в нанесении эффективного количества композиции по п.1, состоящей из активных протеаз, пришитых с помощью ионизирующего излучения к смеси водорастворимых полимеров, для гидролиза упомянутых выше белков. 16. Способ по п.15, в котором композиция наносится местной апликацией, бронхоскопически, впрыскиванием, распылением аэрозоля, при помощи троакара, катетера или турунды. 17. Способ по п.15, в котором упомянутыми протеазами являются субтилизин,трипсин,химотрипсин, папаин или стрептокиназа. 18. Способ по п. 17, в котором упомянутой протеазой является субтилизин. 19. Способ по п.15, в котором упомянутым водорастворимым полимером является полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт или декстран. 20. Способ по п. 19, в котором упомянутым полимером является полиэтиленгликоль.