Средство (варианты) и способ, обеспечивающие увеличение количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в крови млекопитающих

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ,ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ УВЕЛИЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И/ИЛИ ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ(57) Разработаны средство (варианты) и способ,обеспечивающие увеличение количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови млекопитающих. Способ включает введение дефибротида в комбинации или в непосредственной временной близости, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором (предпочтительно -), обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. 15579 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области медицины и, в частности, композиции, способной увеличивать количество стволовых клеток и клетокпредшественников в циркуляции периферической крови у млекопитающих. Предложенная композиция отличается тем, что она содержит дефибротид в комбинации, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники, предпочтительно -. Уровень техники Возможность получения повышенного количества стволовых клеток и клеток-предшественников в циркуляции периферической крови у млекопитающих, и, в частности, у человека, в течение многих лет была предметом интенсивных исследований. Доступность стволовых клеток и/или клетокпредшественников является очень важной в таких областях, как аутогенная трансплантация циркулирующих клеток-предшественников, аллотрансплантация, циркулирующих клеток-предшественников и генная терапия циркулирующих гематопоэтических клеток. Хотя после рождения стволовые клетки и клетки-предшественники находятся почти исключительно в костном мозге, тем не менее, они обладают миграционными свойствами то есть иными словами, в физиологических условиях они мигрируют через полости костного мозга и вовлекают в циркуляцию. Этот процесс, обычно известный как активация, может быть усилен у млекопитающих за счет различных обработок, таких как например,введение цитокинов, и в особенности фактора роста колоний гранулоцитов (-). Обратный процесс,известный как хоминг, происходит, например, у облученных реципиентов после трансплантации гематопоэтических клеток. Однако механизм, лежащий в основе активации и хоминга, остается еще неясным. (.4--, , . 90,12, 1997, . 4779-4788. , . 101,11, 1998, . 2456-2467 ..,, , . 92,3, 1998,. 894-900). Фактор - (регистрационный номер 143011-2-7/ , 1996, стр. 4558) представляет собой гематопоэтический фактор роста, который незаменим при пролиферации и дифференциации клеток-предшественников гранулоцитов. Он является гликопротеином с молекулярной массой 18-22 кД и обычно образуется в ответ на специфическую стимуляцию под действием множества клеток, включающих моноциты, фибробласты и эндотелиальные клетки. Термин дефибротид(ре 2 гистрационный номер 83712-60-1) означает полидезоксирибонуклеотид, полученный экстракцией ( 3770720 и 3899481) животных и/или растительных тканей. Обычно этот полидезоксирибонуклеотид применяется в виде соли щелочного металла, обычно натрия. Дефибротид обычно используют в связи с его антитромботической активностью( 3829567), хотя его можно применять и в других областях, например, при лечении острой почечной недостаточности ( 4694134) и острой ишемической болезни миокарда ( 4693995). Наконец, в 4985552 и 5223609 описан способ получения дефибротида, который обеспечивает получение продукта с постоянными и хорошо определенными физико-химическими свойствами, не обладающего каким-либо побочным эффектам. В контексте настоящего изобретения термин дефибротид означает любой олигонуклеотид и/или полинуклеотид, полученный экстракцией животных и/или растительных тканей, в частности, органов млекопитающих. Предпочтительно, дефибротид получают в соответствии со способами, описанными в указанных выше патентах, которые, таким образом, необходимо рассматривать как составную часть настоящего изобретения. Еще более предпочтительно, дефибротид получают согласно способам,описанным в патентах США 4985552 и 5223609. Сущность изобретения В настоящем изобретении неожиданно было обнаружено, что активацию стволовых клеток и клеток-предшественников можно увеличить путем введения дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости с гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтически клетки-предшественники. Как можно будет оценить из примеров, введение дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости с гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, позволяет достичь гораздо более высокой степени активации, чем в случае введения одного гематопоэтического фактора. Следовательно, предмет настоящего изобретения включает композицию, содержащую в качестве активных ингредиентов дефибротид в комбинация, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, предпочтительно -. В предпочтительном варианте осуществления предложенная композиция представляет собой водный раствор для инъекции альтернативно композиция может представлять собой два различных раствора, один из которых содержит дефибротид, а другой гематопоэтический фактор,обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. Поэтому композиция, согласно настоящему изобретению, имеет форму объединенного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения указанных выше активных ингредиентов для увели 15579 чения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих. Второй аспект настоящего изобретения включает применение дефибротида в комбинации, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором,обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, для получения композиций, способных увеличить количество стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих, в частности, человека. Наконец, еще один предмет настоящего изобретения включает способ увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих, заключающийся в введении дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники. В качестве гематопоэтического фактора, используемого при разработке настоящего изобретения, был использован другими -. Однако не исключено, что аналогичные результаты могут быть получены с гематопоэтическими факторами, отличающимися от -, которые тем не менее обладают способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, например,такими как фактор роста колоний гранулоцитов и макрофагов (-), 3 лигандЗ , фактор стволовых клеток , тромбопоэтин (ТРО), интерлейкин 8 (-8), и другие, что без сомнения ясно для специалистов в этой области техники. В качестве дефибротида, применяемого в комбинации с - на первой экспериментальной стадии, был использован дефибротид, выпускаемый фирмойпод товарным знаком, полученный согласно способу, описанному в 4985552 и 5223609. Что касается способов введения этих двух активных компонентов, они не ограничиваются для задач настоящего изобретения. Иными словами,дефибротид и гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, можно вводить млекопитающим (и, в частности, человеку) в соответствии со способами и позологией, которые известны в этой области техники. Обычно их вводят перорально, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно, причем последний способ является предпочтительным. Кроме того, эти два активных ингредиента могут быть введены вместе или по отдельности. Иными словами, в первом случае их вводят в виде простой композиции, которая содержит оба активных ингредиента и в которую необязательно, но можно добавить обычные лекарственные эксцепиенты и/или адъюванты, известные в этой области. Альтернативно, оба активных компонента можно вводить одновременно, раздельно или последовательно, а именно в виде двух различных композиций, одна из которых содержит гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, предпочтительно -, а другая содержит дефибротид. Обычно - вводят подкожно в количестве от 5 до 24 мкг/кг, в то время как дефибротидвводят путем непрерывного вливания в количестве от 5 до 15 мг/кг в час в течение 2-7 суток. Как можно будет оценить из приведенных примеров, которые следует рассматривать только как иллюстрации, не ограничивающие это изобретение,введение - в комбинации с дефибротидом мышам, которые являются наиболее распространенной экспериментальной моделью млекопитающих, и обезьянам позволяет достичь гораздо более высокой степени активации, чем в случае введения одного -, с четкими преимуществами для всех тех областей терапии, где желательным является высокий уровень активации. Перечень фигур На Фиг. 1 показана кинетика числа лейкоцитов На Фиг. 2 показано число клеток, образующих колонии , в периферической крови На Фиг. 3 показана частота клеток, образующих колонии , в периферической крови На Фиг. 4 показаны уровнина 5 сутки терапии На Фиг. 5 показана доляна 5 сутки терапии На Фиг. 6 показана кинетика клеток, стимулирующих колонии с высокой пролиферативной активностью (-) Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1 Этот эксперимент проводят для того, чтобы оценить влияние от введения - и/или дефибротида на число лейкоцитов , присутствующих в крови мышей. Мышам / в возрасте от 6 до 8 недель с массой тела от 20 до 25 г внутрибрюшинно инъекцировали - (5 мкг/мышь в сутки),дефибротид (1 мг/мышь в сутки) или - (5 мкг/мышь в сутки) в комбинации с возрастающими дозами дефибротида (1, 10, 15 мг/мышь в сутки). Контрольной группе мышей, не получавшей или дефибротид, внутрибрюшинно инъецировали, содержащий до 1 мышиного сывороточного альбумина (/). Мышей обрабатывают в течение 5 суток и умерщвляют через 3 или 5 суток обработки, или через 3 суток после прекращения терапии. Результаты этого эксперимента приведены на фиг. 1. Для представления каждой группы мышей использованы следующие символы -(24), дефибротид 1 (о) (3), - дефибротид 1(13), -дефибротид 10 ( ) (6),дефибротид 15(23). Среднее число лейкоцитов для контрольной группы мышей(/) составляло 2,870,2106/мл крови данные выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего . Пример 2 3 15579 Кинетика активации клеток, образующих общие колонии , в 1 мл крови мышей из примера 1. Среднее число клетокв / для контрольной группы мышей составляло 3912 на 1 мл крови данные приведены на фиг. 2 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего, которые получены из дублированных культур на образцах для каждого животного в данный момент времени. Пример 3 Изменения частоты суммарного количества клеток, образующих общие колонии (---) на 105 клеток, покрытых слоем кровяного сгустка периферической крови, у мышей, упомянутых в примере 1. Среднее число клетокв / для контрольной группы мышей составляло 3,51 данные приведены на фиг. 3 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного в данный момент времени. Пример 4 Суммарное число клеток, образующих общие колонии (----) на 1 мл крови через 5 суток обработки мышей из примера 1 данные приведены на фиг. 4 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного. Пример 5 Частота суммарного количества клеток, образующих общие колонии (---) для 105 клеток, покрытых слоем кровяного сгустка периферической крови, у мышей,упомянутых в примере 1 данные приведены на фиг. 5 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного. Пример 6 Этот эксперимент проводят для того, чтобы оценить влияние от введения - и/или дефибротида на количество гематопоэтических клетокпредшественников/стволовых клеток (клетки, стимулирующие колонии с высокой пролиферативной активностью или -) в циркуляции в периферической крови обезьян. Исследование проводили на макак-резусах (Масаса ) в возрасте 4-6 лет,имеющих хорошее здоровье и нормальные показатели гематологии и клинической химии. Факторвводили подкожно, 100 мкг/кг, в течение 5 суток, в двух циклах. Дефибротид вводили со скоростью 15 мкг/кг в час с помощью системы непрерывной инфузии в течение 5 суток, на втором цикле. Животных подвергали анестезии для забора крови,введения - и смены пакета лекарств. Результаты этого эксперимента приведены на фигуре 6,из которой можно оценить, что введение - в комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации - у обезьян, который приблизи 4 тельно в 8 раз выше, по сравнению с уровнем, достигаемым при введении одного -. ВЫВОДЫ. Из данных, приведенных на фиг. 1, следует, что введение - в комбинации с дефибротидом приводит к существенному увеличению количества лейкоцитов в циркулирующей крови мышей. В частности, следует отметить, что введение одного дефибротида не влияет на количество лейкоцитов в циркуляции крови. Следовательно, комбинацияи дефибротида обладает неожиданным эффектом (зависящим от дозы)приводит к увеличению числа лейкоцитов, причем этот эффект не является простой суммой двух откликов, не зависящих друг от друга. Фиг. 2-5 ясно демонстрируют, что введениев комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации у мышей, который гораздо выше(от 10 до 100 раз), чем уровень активации, полученный при введении одного -. Наконец, фиг. 6 подтверждает, что введение - в комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации стволовых клеток (-) у обезьян, который приблизительно в 8 раз выше, по сравнению с уровнем, достигаемым при введении одного -. Эффект совместного введения двух активных ингредиентов зависит от дозы, поскольку уровень активации возрастает пропорционально количеству введенного дефибротида во всех случаях пик наивысшей активации достигается приблизительно на пятые сутки после введения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Средство, обеспечивающее увеличение количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в крови млекопитающих,отличающееся тем, что содержит в качестве активных ингредиентов дефибротид и, по меньшей мере,один гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники. 2. Средство по п. , отличающееся тем, что гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники, представляет собой -. 3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой водный раствор. 4. Средство по п.п. 1-3, отличающееся тем, что дополнительно содержит приемлемые лекарственные эксцепиенты и/или адыованты. 5. Средство, обеспечивающее увеличение количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в крови млекопитающих,отличающееся тем, что содержит в качестве активных ингредиентов дефибротид и, по меньшей мере,один гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники, для одновременного, раздельного или последовательного введения млекопитающему. 6. Средство по п. 5, отличающееся тем, что состоит из двух различных растворов, вводимых раз 15579 дельно, причем один содержит гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, а другой содержит дефибротид. 7. Средство по п. 5 или 6, отличающееся тем,что гематопоэтический фактор, обладгающий способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники., представляет собой -. 8. Средство по п.п. 5-7, отличающееся тем,чтодополнительно содержит приемлемые лекарственные эксцепиенты и/или адьюванты. 9. Способ, обеспечивающий увеличение количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в крови млекопитающих,отличающийся тем, что млекопитающему вводят средство, включающее дефибротид и, по меньшей мере, один гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, или вводят дефибротид и, по меньшей мере, один гематопоэтический фактор,обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, по отдельности, одновременно, раздельно в непосредственной временной близости или последовательно. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники, представляет собой -. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, чтовводят в количестве от 5 до 24 мкг/кг, а дефибротид вводят в количестве от 5 до 15 мг/кг в час. 12. Способ по п. 11, отличающийся тем, чтои дефибротид вводят в течение 2-7 суток. 13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что млекопитающее представляет собой человека.